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Umwelt

제브라피시 유충에 대한 환경 오염물질의 신경행동 효과 연구

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60818
, , , ,
1State Key Laboratory of Marine Geology,Tongji University, 2Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering,Tongji University, 3Shanghai Collaborative Innovation Centre for WEEE Recycling,WEEE Research Center of 10 Shanghai Polytechnic University, 4Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security

Summary

이 논문에서는 제브라피쉬 유충 모델을 이용한 환경 오염물질의 신경행동 독성 평가를 위한 상세한 실험 프로토콜이 제시되며, 여기에는 노출 과정과 신경행동 지표에 대한 테스트가 포함된다.

Abstract

최근 몇 년 동안 점점 더 많은 환경 오염 물질이 특히 유기체의 초기 개발 단계에서 신경 독성이 입증되었습니다. 얼룩말유충은 환경 오염 물질의 신경 행동 연구를위한 탁월한 모델입니다. 여기서, 배아의 수집, 노출 과정, 신경행동지표, 시험과정 등을 포함하는 제브라피쉬 유충을 이용한 환경오염물질의 신경독성평가를 위한 상세한 실험 프로토콜이 제공되고, 데이터 분석을 제공합니다. 또한, 배양 환경, 노출 과정 및 실험 조건은 분석의 성공을 보장하기 위해 논의된다. 이 프로토콜은 정신 병증 약물의 개발, 환경 신경 독성 오염 물질에 대한 연구에 사용되었으며, 해당 연구를 수행하거나 기계론 적 연구에 도움이되도록 최적화 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라피시 유충에 대한 신경 행동 효과를 연구하기 위한 명확한 작동 과정을 보여주며 다양한 신경 독성 물질 이나 오염 물질의 효과를 밝힐 수 있습니다.

Introduction

최근 몇 년 동안 점점 더 많은 환경 오염 물질이 신경 독성1,2,3,4로입증되었습니다. 그러나, 환경 오염 물질에 노출 된 후 생체 내에서 신경 독성의 평가는 내분비 중단 또는 발달 독성만큼 쉽지 않다. 또한, 오염 물질에 대한 조기 노출, 특히 환경 관련 용량에서, 독성 연구에서 증가 관심을 끌고있다5,6,7,8.

Zebrafish는 환경 오염 물질에 노출 된 후 초기 개발 중에 신경 독성 연구에 적합한 동물 모델로 설립되고 있습니다. 얼룩말물고기는 수정 후 다른 종보다 빠르게 발달하는 척추동물입니다. 유충은 융모의 영양소가 7일 동안 유지하기에 충분하기 때문에 먹이를 줄 필요가 없다(dpf)9. 유충은 ~2 dpf에서 융모에서 나오고3-4 dpf14, 15,16, 17,18에서시작하여 행동 계기10,11,12,13을 사용하여 관찰, 추적, 정량화 및 분석할 수 있는 수영 및 선회등의 행동을 개발한다. 또한 동작 계측기에서도 높은 처리량 테스트를 실현할 수 있습니다. 따라서, 제브라피쉬 유충은 환경오염물질19의신경행동연구에 뛰어난 모델이다. 여기서, 프로토콜은 빛 자극하에 제브라피시 유충에 대한 환경 오염 물질의 신경 행동 독성을 연구하기 위해 높은 처리량 모니터링을 사용하여 제공됩니다.

우리 실험실은 2,2′,4,4′-테트라 브로 모디 페닐 에테르 (BDE-47)20,21,6′-Hydroxy / 메톡시 -2,2′, 4,4′-te의 신경 행동 독성을 연구했습니다. 트라브로모모디페닐 에테르(6-OH/MeO-BDE-47)22,데카 브롬화 디페닐 에테르(BDE-209), 납, 및 상업적 염소처리된 파라핀(23)을 제시된 프로토콜을 사용한다. 많은 실험실은 또한 애벌레 또는 성인 물고기에 다른 오염 물질의 신경 행동 효과를 연구하기 위해 프로토콜을 사용24,25,26,27. 이러한 신경행동 프로토콜은 비스페놀 A및 치환비스페놀 S에 저용량 노출이 배아제브라피시(27)에서조기 시상하부 신경발생을 유도한다는 것을 보여주는 기계적 지원을 제공하는 데 사용되었다. 또한 일부 연구자들은 해당 연구를 수행하기 위해 프로토콜을 최적화했습니다. 최근 연구는 카제인 코팅 금 나노 입자 (βCas AuNPs)를 사용하여 쉽게, 높은 처리량 제브라피시 모델에서 아밀로이드 베타 (Aβ)의 독성을 제거했다. βCas AuNPs는 제브라피쉬 유충및 격리된 내측 Aβ42의 혈액-뇌 장벽을 가로질러 전이되는 전신 순환에서 βCas AuNPs가 행동병리학28에의해 지지된 비특이적, 샤페론 유사 방식으로 독성을 유도하는 것으로 나타났다.

운동, 경로 각도 및 사회 활동은 제시된 프로토콜에서 오염물질에 노출된 후 제브라피시 유충의 신경 독성 효과를 연구하는 데 사용되는 세 가지 신경 행동 지표이다. 운동은 유충의 수영 거리에 의해 측정되고 오염 물질에 노출 된 후 손상 될 수 있습니다. 경로 각도 및 사회 활동은 뇌및 중추신경계(29)의기능과 더 밀접하게 관련되어 있다. 경로 각도는 수영방향(30)을기준으로 동물 운동 경로의 각도를 의미한다. ~-180°~+180°의 8개의 각도 클래스가 시스템에 설정되어 있습니다. 비교를 단순화하기 위해 최종 결과의 6 개 클래스는 일상적인 회전 (-10 ° ~ ~ 0 ° ~ + 10 °), 평균 회전 (-10 ° ~ ~ – 90 ° , + 90 ° ), 응답 회전 (-180 ° ~ ~ – 90 °, +90 ° ~ + 180 °)으로 정의됩니다22. 두 물고기 사회 활동은 그룹 shoaling 행동의 기본; 여기서 유효한 두 애벌레 사이의 거리 (0.5 cm)는 사회적 접촉으로 정의됩니다.

여기에 제시된 프로토콜은 제브라피시 유충에 대한 신경 행동 효과를 연구하기 위한 명확한 과정을 보여주고 다양한 물질 또는 오염 물질의 신경 독성 효과를 밝히는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 환경 오염 물질의 신경 독성을 연구하는 데 관심이있는 연구자에게 도움이 될 것입니다.

Protocol

이 프로토콜은 동지대학교 동물윤리위원회의 승인을 받은 지침에 따른 것입니다. 1. 제브라피쉬 배아 수집 노출 전날 밤에 건강한 성인 튜빙겐 제브라피시 2쌍을 산란상자에 넣고 성비를 1:1로 유지합니다. 다음날 아침 일광 후 30-60 분 시스템에 다시 성인 물고기를 제거합니다. 산란 상자에서 배아를 제거합니다. 배아를 시스템 물로 헹구고 있습?…

Representative Results

여기서, 우리는 빛 자극하에 제브라피쉬 유충을 사용하여 환경 오염 물질의 신경 행동 효과를 연구하기위한 프로토콜을 설명합니다. 운동, 경로 각도 및 사회 활동 테스트는 소개에 정의되어 있습니다. 운동 및 경로 각도 테스트에서 마이크로 플레이트의 설정과 소프트웨어의 이미지는 다음과 같습니다. 또한, 우리 자신의 연구 결과는 예로 제시된다. 2개의 연구 결과는 BD…

Discussion

이 작업은 제브라피시 유충을 사용하여 환경 오염 물질의 신경 독성을 평가하기 위한 상세한 실험 프로토콜을 제공합니다. Zebrafish는 노출 기간 동안 배아에서 유충으로 과정을 거치므로 배아와 유충을 잘 돌보는 것이 필수적입니다. 배아와 애벌레의 발달에 영향을 미치는 모든 것이 최종 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서 배양 환경, 노출 과정 및 실험 조건은 전체 분석의 성공을 보장하기…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 중국 국립 자연 과학 재단 (21876135 및 21876136), 중국의 국가 주요 과학 기술 프로젝트 (2017ZX07502003-03, 2018ZX077010101-22), MOE-상하이 재단의 재정 지원에 감사드립니다. 어린이 환경 보건의 주요 실험실 (CEH201807-5), 스웨덴 연구위원회 (번호 639-2013-6913).

Materials

48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software
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Keywords: Neurobehavioral EffectsEnvironmental PollutantsZebrafish LarvaeHigh Throughput TestingNeurotoxicityZebrafish GenomePsychotropic DrugsEnvironmental ToxicologyLocomotionPath AngleSocial BehaviorHigh Throughput Monitoring SoftwareTracking RotationsProtocol Parameters
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Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).
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