Realización de biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y evaluación de cambios de tejido posteriores
Summary
Aquí, proporcionamos una descripción detallada del procedimiento para inducir biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y el cierre de heridas de vía en tiempo real. Además, se proporcionan métodos para la preparación de tejidos para análisis histológicos, inmunohistoquímicos y moleculares del lecho de la herida.
Abstract
Entender los cambios tisulares y celulares que se producen en la respuesta aguda a lesiones, así como durante el proceso de curación de heridas es de suma importancia al estudiar enfermedades del tracto gastrointestinal (GI). El modelo de biopsia de pellizco colonico turbio es una herramienta útil para definir estos procesos. Además, se puede estudiar la interacción entre el contenido luminal intestinal (por ejemplo, microbios) y el colon. Sin embargo, la inducción de heridas y la capacidad de rastrear el cierre de heridas con el tiempo de una manera confiable pueden ser desafiantes. Además, la preparación y orientación de los tejidos debe llevarse a cabo de manera estandarizada para interrogar de manera óptima los cambios histológicos y moleculares. Aquí, presentamos un método detallado que describe la lesión inducida por biopsia y el monitoreo del cierre de heridas a través de colonoscopias repetidas. Se describe un enfoque que garantiza mediciones consistentes y reproducibles del tamaño de la herida, la capacidad de recoger el lecho de la herida para análisis moleculares, así como visualizar el lecho de la herida al seccionar los tejidos. La capacidad de llevar a cabo con éxito estas técnicas permite estudios de la respuesta aguda a lesiones, la cicatrización de heridas y las interacciones luminal-huésped dentro del colon.
Introduction
El tracto gastrointestinal (GI) es un complejo sistema de órganos dadas sus múltiples funciones, tipos de células huésped (por ejemplo, epitelial, inmune, estromal, etc.) así como billones de microbios. A la luz de esta complejidad, las enfermedades del tracto gastrointestinal a menudo implican la interacción de todos estos factores. Por ejemplo, las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) se asocian con ciclos de inflamación y remisión en el tracto gastrointestinal, que implican la activación de células inflamatorias, disbiosis y reparación epitelial1,2,3,4,5,6,7. Tener sistemas modelo adecuados para estudiar la EII y otras condiciones inflamatorias del tracto gastrointestinal es fundamental para dilucidar la patogénesis de la enfermedad. Existen varios modelos para estudiar la patogénesis del EII, incluidos ratones genéticamente modificados y el uso de sustancias químicas como el sulfato sódico de dextrano (DSS) en roedores8,9,10. Las limitaciones de estos modelos incluyen la incapacidad de controlar con precisión la inducción de la inflamación, así como dificultades en la evaluación de la cicatrización de heridas. Los métodos alternativos para imitar aspectos de la patogénesis de la EII podrían resultar útiles para el desarrollo de terapias.
Las biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones ofrecen un sistema modelo útil para estudiar la patogénesis de la respuesta inflamatoria, la cicatrización de heridas, así como las interacciones huésped-microbio en el colon. Este enfoque se utilizó por primera vez como una herramienta experimental en 2009, que demostró su utilidad para estudiar la respuesta inflamatoria aguda y la cicatrización de heridas en el intestino11. Estudios posteriores utilizaron esta técnica para evaluar los roles de las diferentes vías de señalización, así como la microbiota intestinal, en la cicatrización de heridas en colones11,12,13,14,15,16,17,18. Más recientemente, nuestro grupo utilizó este modelo para investigar la importancia de la señalización de esfingosina-1-fosfato y bacterias en la respuesta aguda a lesiones en colones19. Aunque útil, llevar a cabo biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicos en ratones y evaluar los cambios de tejido posteriores puede ser técnicamente difícil. Por ejemplo, la perforación del intestino puede ocurrir tras la inducción de lesiones y asegurar mediciones consistentes del lecho de la herida a través de colonoscopias en serie puede ser difícil. Además, orientar el tejido colonico correctamente para visualizar el lecho de la herida para análisis histológicos o inmunohistoquímicos puede ser un desafío. Aunque existe cierta información sobre estos métodos18,20, una descripción precisa de estas técnicas a lo largo de las ayudas visuales promete mejorar la fiabilidad y la utilidad más amplia de este modelo. Aquí, presentamos un método detallado para llevar a cabo biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones, rastrear el cierre de heridas con el tiempo y preparar el tejido para permitir análisis histológicos y moleculares del lecho de la herida. La creación de un método estándar para llevar a cabo estas técnicas puede ampliar el uso de este modelo para estudiar mediadores previamente no investigados que son potencialmente importantes para la inflamación gastrointestinal y la reparación de heridas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Garantizar biopsias consistentes y precisas, así como mediciones del tamaño de la herida, son de suma importancia cuando se intenta evaluar eficazmente la tasa de cierre de heridas en este modelo. Por lo tanto, deben adoptarse varias medidas para estar seguros de que los procedimientos se están llevando a cabo correctamente. En primer lugar, la profundidad de la biopsia no debe ser demasiado superficial o profunda. Si es demasiado superficial, no habrá una ventana suficiente para evaluar el cierre de la herida. <stro…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de crohn’s and Colitis Foundation (D.C.M) y New York Crohn’s Foundation (D.C.M. y A.J.D.). Los autores agradecen a la Sra. Carmen Ferrara su ayuda para crear el acompañamiento en vídeo de este artículo.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
Referenzen
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
