Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto
Summary
O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.
Abstract
A análise experimental das células que se dividem em tecidos e órgãos vivos e intactos é essencial para nossa compreensão de como a divisão celular se integra com o desenvolvimento, homeostase tecidual e processos de doenças. Os espermatocitos drosophila submetidos a meiose são ideais para esta análise porque (1) testículos de Drosophila inteiros contendo espermatocitos são relativamente fáceis de preparar para a microscopia, (2) o tamanho grande dos espermatocitos os torna adequados para imagens de alta resolução, e (3) poderosas ferramentas genéticas drosophila podem ser integradas com análise viva. Aqui, apresentamos um protocolo facilmente acessível para a preparação de testículos inteiros de larvas de Drosophila terceira instar e pupas precoces. Descrevemos como identificar espermatocitos meióticos em testículos inteiros preparados e como imaginá-los vivendo por microscopia de lapso de tempo. Também são fornecidos protocolos de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. O uso de testículos larvais tem várias vantagens sobre os protocolos disponíveis que usam testículos adultos para análise de espermatocitos. Mais importante, os testículos larvais são menores e menos cheios de células do que testículos adultos, e isso facilita muito a imagem de alta resolução de espermatocitos. Para demonstrar essas vantagens e as aplicações dos protocolos, apresentamos resultados mostrando a redistribuição do retículo endoplasmático em relação aos microtúbulos do fuso durante a divisão celular em um único espermatocito, imagem por microscopia confocal de lapso de tempo. Os protocolos podem ser combinados com a expressão de qualquer número de proteínas ou marcadores de organela fluorescentemente marcados, bem como mutações genéticas e outras ferramentas genéticas, tornando esta abordagem especialmente poderosa para a análise de mecanismos de divisão celular no contexto fisiológico de tecidos e órgãos inteiros.
Introduction
A divisão celular é frequentemente estudada usando linhas celulares cultivadas na cultura1. Embora tenhamos adquirido uma riqueza de insights inestimáveis e compreensão de mecanismos fundamentais a partir desses estudos2, as células cultivadas na cultura não podem recapitular totalmente a fisiologia da divisão celular como ocorre em tecido vivo intacto. Por exemplo, em tecidos e órgãos intactos, as células devem se dividir no lugar certo e no momento certo para que as células prole estejam adequadamente situadas dentro do tecido, para que possam se submeter a programas de diferenciação ou funcionais adequados, e para que a proliferação celular seja devidamente coordenada com o crescimento tecidual ou a homeostase3. Para as células cultivadas na cultura, por outro lado, a divisão celular é geralmente regulada por fatores de crescimento no meio de cultura4, e, portanto, não podemos aprender com essas células como fatores ambientais in vivo, como arquitetura tecidual ou sinalização de desenvolvimento, influenciam o processo de divisão. Também é importante notar que muitas das linhas celulares usadas para estudar a divisão celular, como as células HeLa e U2OS, foram derivadas de tumores metastáticos5. Portanto, muitos aspectos da fisiologia básica dessas células cancerosas, como mecanismos de regulação do ciclo celular e estabilidade cromossômica, provavelmente foram alterados em comparação com células saudáveis. A compreensão completa da fisiologia da divisão celular, portanto, depende de nossa capacidade de estudar células divisórias em seus ambientes nativos, in vivo, que preservam mecanismos regulatórios fisiológicos e arquitetura tecidual.
Os avanços na compreensão de como a divisão celular opera dentro de tecidos e órgãos intactos são dificultados por dificuldades inerentes à análise in vivo ou ex vivo. Primeiro, pode ser difícil ou impossível acessar células divisórias para análise microscópica dentro de órgãos grandes ou tecidos grossos. Em segundo lugar, muitas vezes é difícil prever quando as células individuais se dividirão in vivo. Em terceiro lugar, a fisiologia do tecido pode se deteriorar rapidamente durante a cultura ex vivo. Neste protocolo, descrevemos métodos facilmente acessíveis para análise viva e fixa de espermatocitos drosophila melanogaster à medida que eles se submetem a divisões de células meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Essas células são ideais para análise viva, ex vivo, pois são facilmente acessíveis com métodos ópticos padrão, como microscopia confocal, se dividem em momentos e locais previsíveis, e testículos intactos podem ser mantidos na cultura ex vivo por até cerca de 24h. Além disso, os espermatocitos drosophila são células redondas grandes (aproximadamente 20-30 μm de diâmetro) que não mudam de forma quando se dividem, tornando-os ideais para imagens de alta resolução e lapso de tempo de componentes celulares, como o aparelho de fuso e organelas citoplasmáticas. Embora essas células sejam submetidas à meiose em oposição à mitose, muitos dos processos essenciais de divisão celular são muito semelhantes entre esses dois mecanismos de divisão celular6. Essas vantagens, combinadas com poderosas ferramentas genéticas drosophila, tornaram drosophila espermatocitos um modelo amplamente utilizado para a análise ex vivo de processos essenciais de divisão celular, incluindo formação e regulação de fuso, citocinese e remodelação de organela77,8,9,10,11.
Spermatocitos são células que estão no estágio meioático da espermatogênese. Em Drosophila,a espermatogênese começa com um grupo de células-tronco germinais que estão localizadas em uma pequena região ou “hub” em um pólo do testículo12,13. Essas células se dividem por uma mitose assimétrica, dando origem a um único espermatogonium diferenciado. A espermatogonia então se submete a quatro mitoses síncronas para produzir um grupo de 16 células que permanecem intimamente associadas dentro de um único cisto. Nesta fase, as células transitam de um ciclo mitótico para um ciclo celular meiótico e são referidas como espermatocitos. Os espermatocitos passam cerca de dois a três dias em um estágio G2 prolongado do ciclo celular, durante o qual crescem dramaticamente e sofrem alterações citológicas na preparação para as duas divisões meióticas e posterior esperetriogênese13,14. Todo o grupo de 16 espermatocitos dentro de um único cisto então entram na primeira divisão meiotica ao mesmo tempo. Assim, vários espermatocitos meióticos meioticos podem ser imagemao mesmo, à medida que prosseguem através da divisão celular. A primeira divisão meiótica prossegue por aproximadamente 1,5 h e é seguida quase imediatamente pela segunda divisão meiotica, produzindo 64 espermatozóides totais que passam a se diferenciar em espermatozoides maduros.
Uma vantagem única do uso de espermatocitos para estudar a divisão celular em tecido vivo e intacto é que grupos ou cistos de células progridem constantemente através dos diferentes estágios da espermatogênese, e as células em todos os estágios da espermatogênese geralmente podem ser identificadas em qualquer determinado testículo (ver Figura 3A). Portanto, é relativamente fácil encontrar células meióticas em testículos inteiros. Geralmente focamos nossas análises na primeira em oposição à segunda meiose porque essas células são muito maiores e mais acessíveis a imagens de alta resolução, mas todo o processo que abrange ambas as divisões meióticas pode ser visto com sucesso. Deve-se notar também que o protocolo geral para preparação e cultura de testículos pode ser usado para analisar outros processos de espermatogênese também, como as divisões mitóticas anteriores ou as formas espermagogoniais ou as alterações citológicas que ocorrem à medida que os espermatids amadurecem em espermatozoides15. Muitos desses aspectos da espermatogênese são altamente conservados entre drosophila e humanos16.
Os espermatocitos drosophila começam a atingir a fase meiótica da espermatogênese durante o terceiro estágio larval instar do desenvolvimento da Drosophila 13. Portanto, testículos isolados dos estágios do ciclo de vida começando com a terceira larva instar e incluindo pupas e adultos podem ser usados para análise de espermatocitos divisórias. Vários protocolos excelentes estão disponíveis para extração de testículos de moscas machos adultas para análise viva e fixa da espermatogênese17,18,19. Esses protocolos podem ser preferíveis para estudar estágios tardios da espermatogênese ou se marcadores genéticos que só são visíveis em adultos devem ser usados. O protocolo se concentra, em vez disso, na preparação de testículos de larvas e pupas precoces, pois os testículos nessas fases têm várias vantagens que são especificamente pertinentes à análise de divisão celular por microscopia de alta resolução e lapso de tempo. Primeiro, os testículos de larvas e pupas são menores do que os de adultos, e as células dentro do órgão são menos aglomeradas. Por causa disso, a divisão de espermatocitos pode muitas vezes ser imagem próxima da superfície externa dos testículos larvais, sem ter que penetrar através de múltiplas camadas de tecido disperso de luz. Em segundo lugar, os testículos adultos se movem ritmicamente devido a contrações dos órgãos acessórios ligados, e esses movimentos tornam a imagem de lapso de tempo de células individuais desafiadora. E terceiro, os testículos larvais são vantajosos ao estudar mutações genéticas que causam letalidade pupal ou adulta. Nossos métodos são otimizados para a cultura de longo prazo dos testículos no estágio do microscópio, permitindo a imagem de múltiplas rodadas de divisão celular ou a progressão de células individuais através de múltiplos estágios de espermatogênese na mesma preparação. Também descrevemos um protocolo de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. No geral, nossos protocolos são particularmente úteis para os interessados em estudar a divisão celular em tecido intacto, e a capacidade de combinar análise de espermatocitos com ferramentas genéticas drosophila altamente tratáveis faz desta uma abordagem especialmente poderosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um protocolo para a preparação de testículos de Drosophila larval ou pupal precoce, otimizados para imagens ao vivo de longo prazo da divisão celular de espermatocitos. Este é um poderoso método de análise da divisão celular no contexto fisiológico do tecido intacto. O poder deste método é ainda mais expandido quando combinado com ferramentas genéticas de Drosophila, como mutações genéticas específicas, supressão mediada por RNAi específica do tecido, e marcadores de prote?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos iniciais do Departamento de Defesa para J.T.S.
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
Referenzen
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