3D сфероидная модель для глиобластомы
Summary
Здесь мы описываем простой в использовании нашествие, чтобы провести гиобластому. Этот ассси подходит для глиобластомы стволовых клеток. Также описывается макрос Фиджи для легкой количественной оценки вторжения, миграции и распространения.
Abstract
Двухмерные (2D) клеточные культуры не имитируют рост опухоли vivo удовлетворительно. Поэтому были разработаны трехмерные (3D) культуры сфероидных моделей. Эти модели могут быть особенно важны в области нейроонкологии. Действительно, опухоли головного мозга имеют тенденцию вторгаться в здоровую среду мозга. Мы описываем здесь идеальный 3D сфероид на основе глиобластомы, который мы разработали для изучения вторжения опухоли. Мы предоставляем все технические детали и аналитические инструменты для успешного выполнения этого ажиотажа.
Introduction
В большинстве исследований с использованием первичных или коммерчески доступных клеточных линий, анализы выполняются на клетках, выращенных на пластиковых поверхностях в качестве монослойных культур. Управление культурой клеток в 2D представляет недостатки, так как она не имитирует среду in vivo 3D-клеток. В 2D-культурах вся поверхность клеток находится непосредственно в контакте со средой, изменяя рост клеток и изменяя доступность лекарств. Кроме того, нефизиологическая пластиковая поверхность вызывает дифференциацию клеток1. Для преодоления этих трудностей были разработаны трехмерные модели культуры. Они имеют то преимущество, имитируя многоклеточной архитектуры и неоднородности опухолей2, и, таким образом, можно считать более актуальной моделью для твердых опухолей3. Сложная морфология сфероидов способствует лучшей оценке лекарственного пенетранса и резистентности4. Неоднородность опухоли в сфероиде влияет на диффузию кислорода и питательных веществ, а также на реакцию на фармакологические агенты(рисунок 1A). Диффузия кислорода изменяется, когда размер сфероида достигает 300 мкм, вызывая гипоксическую среду в центре сфероида(рисунок 1A,C). Метаболиты также менее проникают через клеточные слои и компенсирующие метаболические реакции происходят5. Когда диаметр сфероида увеличивается, некротические ядра могут наблюдаться, дальнейшее имитации характеристики, найденные во многих твердых раковых заболеваний, в том числе агрессивной глиобластомы рака мозга (GBM)6.
Несколько 2D или 3D-анализов на глиобластому были зарегистрированы в литературе7,,8. Двухмерные анализы в основном для изучения вторжения в горизонтальной плоскости на тонком матричном слое или в камере Бойдена анализ9. Трехмерные анализы были описаны с 3D сфероидных культур с использованием классических линий клеток глиобластомы10. Более сложные варианты представлены вторжением органов мозга опухолевыми сфероидами в конфронтационных культурах11. Тем не менее, по-прежнему важно разработать простой в использовании и воспроизводимый результат, доступный для любой лаборатории. Мы разработали протокол для генерации стволовых клеток, похожих на глиобластому, из образцов пациентов. Количественная оценка этих анализов легко управляемыи и требует только открытого доступа в Интернете программного обеспечения. Короче говоря, опухолевые кусочки разрезаются на мелкие кусочки и ферментативно усваиваются. Одиночные клетки выведенные от пищеварения культивируются в нейробазальной среде. Через 4-7 дней сфероидные структуры образуются спонтанно. При внутричерепной имплантации у моделей мышей, они образуют опухоли, демонстрирующие некротический ядро, окруженное псевдо-палисадингклетками12. Это очень напоминает характеристики, найденные у пациентов с ГБМ.
В этой статье мы описываем наш протокол для производства сфероидов из определенного количества клеток для обеспечения воспроизводимости. Для этой цели можно использовать две дополнительные матрицы: Matrigel и коллаген i тип. Matrigel обогащается факторами роста и имитирует базальную мембрану млекопитающих, необходимую для клеточной привязанности и миграции. С другой стороны, коллаген типа I, структурный элемент стромы, является наиболее распространенной фибриллярной внеклеточной матрицы и используется в анализы клеточного вторжения. В этом мы иллюстрируем нашу модель сфероидов GBM, выполняя анализы миграции и распространения. Анализ проводился не только в фиксированные временные моменты, но и путем мониторинга расширения сфероидов и движения клеток с помощью живой визуализации. Кроме того, была сделана электронная микроскопия для визуализации морфологических деталей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опухолевые сфероидные анализы хорошо приспособлены для изучения характеристик опухоли, включая пролиферацию, вторжение и миграцию, а также гибель клеток и ответные меры на наркотики. Раковые клетки вторгаются в 3D-матрицу, образуя инвазивную микроопухоль, как видно на рисун…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde et de la Charente-Maritime). Джорис Гайон является получателем стипендий из университетской больницы Тулузы (CHU Тулуза).
Materials
| 96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
| Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |
Referenzen
- Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
- Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
- Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver’s seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
- Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
- Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
- Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Krebsforschung. 68, 7247-7249 (2008).
- Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
- Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
- de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter’s Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
- Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).
