تحليل تدفق الخلايا الخلوية من المجموعات الفرعية الخلية المناعية داخل الطحال مورين, نخاع العظام, الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلي في نموذج هشاشة العظام
Summary
هنا، نحن وصف مفصلة واستنساخ تدفق العلاج الخلوي بروتوكول لتحديد أحادية / الضامة والخلايا التائية باستخدام كل من خارج وداخل الخلايا تلطخ المقايسات داخل الطحال مورين، نخاع العظام، والعقد الليمفاوية والأنسجة الزليلي، وذلك باستخدام نموذج جراحية راسخة من هشاشة العظام.
Abstract
هشاشة العظام (OA) هي واحدة من أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا، مما يؤثر على المرضى الذين يعانون من الألم والقيود الجسدية. وتشير الأدلة الحديثة إلى وجود عنصر التهابي محتمل للمرض، مع احتمال ارتباط كل من الخلايا التائية والخلايا أحادية الخلايا/الضامة بتولدات المرض من الزراعة العضوية. وقد افترضت دراسات أخرى دوراً هاماً لكل من مجموعات فرعية من أنساب الخلايا الالتهابية، مثل Th1 وTh2 وTh17 و T-تنظيمية لللمفيات، و M1 و M2 و الضامة السينوفية للأنسجة المقيمة. ومع ذلك، فإن التفاعل بين الاستجابة الخلوية الالتهابية المحلية والنظامية والتغيرات الهيكلية في المفصل غير معروف. لفهم كامل كيف تي الخلايا monocytes / الضامة تسهم في الزراعة العضوية، من المهم أن تكون قادرة على تحديد كمي هذه الخلايا و المجموعات الفرعية الخاصة بهم في وقت واحد في الأنسجة الزليلي، والأعضاء اللمفاوية الثانوية وبشكل نظامي (الطحال ونخاع العظام). في الوقت الحاضر، يمكن تحديد المجموعات الفرعية الخلية الالتهابية المختلفة من خلال مزيج من علامات سطح الخلية مما يجعل عملية استئصال الخلايا متعددة الألوان تقنية قوية في التحقيق في هذه العمليات الخلوية. في هذا البروتوكول، ونحن وصف الخطوات التفصيلية بشأن حصاد الأنسجة الزليلي والأعضاء اللمفاوية الثانوية، فضلا عن توليد تعليق خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، نقدم كل من فحص تلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات / الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بهم، فضلا عن فحص تلطيخ خارج وداخل الخلوية لتحديد الخلايا التائية وتفرعاتها داخل طحال المورين، نخاع العظام، الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية. تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول واختبارها ، مما أدى إلى اختبار قابل للاستنساخ للغاية يمكن استخدامه لنماذج أخرى من ماوس الزراعة العضوية الجراحية وغير الجراحية.
Introduction
هشاشة العظام (الزراعة العضوية) هو مرض موهن ومؤلم يشمل مختلف الأمراض من جميع الأنسجة المرتبطة بالمفصل1. تؤثر على ما يقرب من 3.8٪ من سكان العالم2, الزراعة العضوية هي واحدة من أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا وأنه من أن تصبح السببالرئيسي 4 من الإعاقة في جميع أنحاء العالم بحلول عام 20203. بعد الصدمة الزراعة العضوية يحدث بعد إصابة المفاصل وحسابات لا تقل عن 12٪ من جميع الزراعة العضوية وما يصل إلى 25٪ من الزراعة العضوية في المفاصل عرضة مثل الركبة4,5. وعلاوة على ذلك، فإن إصابة المفاصل تزيد من خطر100000000000000000000000000000000000000000000000000000 لن تستمر جميع الإصابات التي يبدو أنها غير مُتشابهة في تطوير الزراعة العضوية، وبالتالي فإن تحديد العوامل التي تدفع خطر الزراعة العضوية على المدى الطويل لا يزال يشكل تحدياً. ومن الأهمية بمكان من أجل تطوير علاجات فعالة لمنع و / أو علاج الزراعة العضوية بعد الصدمة ، للتحقيق وتحديد أفضل الأمراض المتعلقة بالإصابات ، والأسباب ، والآليات التي تهيئ لOA1.
OA والتدمير الغضروف تعريفه كان يعزى سابقا تماما إلى الإجهاد الميكانيكية، وهكذا، كان يعتبر OA مرض غير الالتهابي2. ومع ذلك، أظهرت دراسات أكثر حداثة تسلل التهابي من الأغشية الزليلية وزيادة الخلايا الالتهابية في الأنسجة الزليلية في المرضى الذين يعانون من الزراعة العضوية مقارنة مع الضوابط الصحية2، تسليط الضوء على عنصر التهابي كقوة دافعة محتملة في الزراعة العضوية. وأشارت دراسات أخرى إلى أن شذوذ في كل من CD4 + و CD8 + T-الخلية الشخصية وكذلك monocytes / الضامة من الجهاز المناعي الفطرية قد تسهم في التسبب فيOA 2,7. وكشفت التحقيقات التفصيلية في هذه التشوهات الأدوار ذات الصلة لمختلف المجموعات الفرعية خلية T2، مثل Th18، Th29، Th178 و T التنظيمية (Treg) السكان10،11. على الرغم من هذه الأدلة الدامغة ، فإن العلاقة السببية بين تغيير استجابات الخلايا التى وتطور وتطور الزراعة العضوية لا تزال غير معروفة2.
بالإضافة إلى خلايا تي محددة لها دور في الزراعة العضوية، تشير الدراسات الحديثة إلى أن الضامة المستقطبة /المنشطة قد تكون مرتبطة بتولدية OA12. على وجه الخصوص، الضامة التي تنشأ من أحاديات الدم تتراكم في السينوفيوم والاستقطاب في إما الضامة المنشطة كلاسيكيا (M1) أو بدلا من ذلك تفعيل الضامة (M2) أثناء التنمية الزراعة العضوية، مما يعني وجود علاقة بين الضامة المشتقة monocyte وOA13. في المقابل، مجموعات فرعية معينة من الضامة ملء الأعضاء في وقت مبكر أثناء التنمية والاكتفاء الذاتي أعدادهم في مادة مستقلة monocyte14. في الآونة الأخيرة، تم عرض وظيفة حماية مشتركة بوساطة حاجز ضيق الوصل لهذه الضامة الزليلية الأنسجة المقيم (STRMs)14. وتشير هذه النتائج إلى أن الشذوذ في مجموعات فرعية خاصة من الضامة قد تلعب دوراً حاسماً أثناء تطوير الزراعة العضوية. ومع ذلك، فإن التفاعلات بين هذه الاستجابة الخلوية الالتهابية والتغيرات الهيكلية في المفصل اللاحق للصدمة غير معروفة.
تاريخيا، كان يقتصر تحليل الخلايا المناعية في الأنسجة الزليلية على الكيمياء المناعية (IHC) أو التعبير مرنا عن طريق عكس النسخ تفاعل البوليمرات سلسلة (RT-PCR) النهج15،16. ومع ذلك، فإن كلا من IHC وRT-PCR تفتقر إلى القدرة على تحديد أنواع مختلفة متعددة من الخلايا و مجموعاتها الفرعية في وقت واحد، وبالتالي الحد من إمكانية تطبيق هذه الطرق. وعلاوة على ذلك، يقتصر IHC لتحليل عينات صغيرة من الأنسجة، وقد يغيب عن تراكم الخلايا الالتهابية البؤري. على مدى السنوات القليلة الماضية، تم تطوير عدد لا يحصى من علامات السطح لأنواع مختلفة من الخلايا، ويمكن الآن تحديد مجموعات فرعية من الخلايا المناعية بشكل موثوق من خلال مجموعات متميزة من هذه العلامات. بسبب التقدم التقني المطرد، أجهزة قياس التدفق قادرة الآن على تحديد العديد من الفلوروكرومات المختلفة في وقت واحد مما يتيح تحليل لوحات الأجسام المضادة متعددة الألوان الكبيرة.
يوفر قياس التدفق الخلوي للمحققين تقنية قوية تسمح بتحديد وقياس كمية العديد من الخلايا المناعية و المجموعات الفرعية الخاصة بها على مستوى الخلية المفردة. لقد طورنا وحسّنا كل من مقايسة تلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات / الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بهم وكذلك مقايسة تلطيخ إضافية / داخل الخلايا لتحديد الخلايا التائية و مجموعاتها الفرعية داخل طحال المورين ونخاع العظام والغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية. تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول واختبارها مما أدى إلى محك قابل للاستنساخ للغاية يمكن استخدامه لنماذج أخرى ماوس OA الجراحية وغير الجراحية17.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تصميم واختبار الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول لتحديد موثوق مجموعات فرعية مختلفة من كل من أحادية الخلايا / الضامة والخلايا التائية داخل الطحال مورين، نخاع العظام، والغدد الليمفاوية، والأنسجة الزليلي في نموذج مورين من هشاشة العظام (الزراعة العضوية). يمكن تعديل البروتوكول الحالي بس…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أندرو ليم، دكتوراه وجايلز بيست، دكتوراه لمساعدتهم في إعداد تدفق مقياس المقاييس. وقد دعم هذا المشروع دويتشه هـيـزنغـسجيمينشافت (DFG-HA 8481/1-1) الذي مُنح لـ PH.
Materials
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel | |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel | |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel | |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue | |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel | |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel | |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel | |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel | |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel | |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel | |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel | |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel | |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel | |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel | |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel | |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel | |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel | |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel | |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel | |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel | |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel | |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers | Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): . |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
Referenzen
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
- Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
- Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
- Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
- Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
- Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
- Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
- Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
- Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
- Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints–analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
- Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
- Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
- Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
- Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
- Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
- Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).
