Индукция Leptomeningeal клеток Модификация через интрасистскую инъекцию
Summary
Мы описываем intracisternal инъекции, которая использует иглу согнуты на кончике, которые могут быть стабилизированы к черепу, тем самым устраняя риск повреждения основной parenchyma. Этот подход может быть использован для генетического отображения судьбы и манипуляций лептоменангеновых клеток и для отслеживания движения спинномозговой жидкости.
Abstract
В описанном здесь протоколе описывается, как безопасно и вручную вводить растворы через цистерну Магна, устраняя при этом риск повреждения основной паренхимы. Ранее опубликованные протоколы рекомендуют использовать прямые иглы, которые должны быть снижены до максимум 1-2 мм от поверхности dural. Внезапное падение сопротивления после того, как dural мембрана была проколота делает его трудно поддерживать иглу в устойчивом положении. Наш метод, вместо этого, использует иглу согнуты на кончике, которые могут быть стабилизированы против затылочной кости черепа, тем самым предотвращая шприц от проникновения в ткани после перфорации dural мембраны. Процедура проста, воспроизводима и не вызывает длительного дискомфорта у оперированных животных. Мы описываем стратегию инъекций в контексте генетической судьбы, отображающей сосудистые лептоменингеальные клетки. Кроме того, тот же метод может быть использован для решения широкого круга научных вопросов, таких, как зондирование роли лептоменингов в нейроразвитии и распространении бактериального менингита, путем генетической абляции генов, которые, как предполагается, причастны к этим явлениям. Кроме того, процедура может быть объединена с автоматизированной инфузионной системой для постоянной доставки и использована для отслеживания движения спинномозговой жидкости через инъекцию флуоресцентно обозначенных молекул.
Introduction
Leptomeningeal клетки фибробласт-как популяция клеток организованы в тонком слое наложения мозга и выражения генов, причастных к коллагена перекрестные (например, Dcn и Лам), и в создании мозга менингеального барьера (например, Cldn11)1,2. Лептоменингеальные клетки вовлечены в широкий спектр физиологических функций, от строгого контроля над спинномозговой жидкости дренажажиотажа 3 для руководства нейронных прародителей в развивающихся мозга4,5. Недавнее исследование также предложило, что лептоменинги у новорожденного могут гавани радиальных глиаподобных клеток, которые мигрируют в мозг паренхимы и развиваются в функциональные корковые нейроны6.
Лептоменингеальные клетки расположены в непосредственной близости от поверхностных астроцитов и делятся с ними, а также другими паранхимальной астроглией, выражением коннексина-30 (Cx30)7. Хирургическая процедура, описанная ниже, позволяет широко и специфическую маркировку этих менингеальных клеток с помощью одноразовой доставки эндоксифена в+ цистерну магны трансгенных мышей, условно выражающих tdTomato в клетках Cx30 (т.е., с помощью системы CreER-loxP для картирования судьбы). Эндоксифен является активным метаболитом тамоксифена и индуцирует рекомбинацию Клеток, выражающих CreER, так же, как и тамоксифен. Это, однако, рекомендуемое решение для местного применения, поскольку он растворяется в 5-10% DMSO, вместо высоких концентраций этанола. Кроме того, эндоксифен не пересекает мозг-менингеальный барьер, тем самым позволяя специфическую рекомбинацию лептоменингеальных клеток, без маркировки лежащих в основе Cx30– астроглиальной популяции (см. Представитель Результаты).
Техника, представленная здесь, направлена на ручной и безопасной инъекции соединения в спинномозговой жидкости, через прямой доступ к цистерны magna. В отличие от других, более инвазивных процедур, требующих краниотомии, этот подход позволяет наполнить соединения без нанесения ущерба черепу или мозгу паренхимы. Таким образом, это не связано с индукцией воспалительных реакций, вызванных активацией клеток паренхимальной глии. Как и другие стратегии инъекций, описанные до8,9,10, нынешний подход опирается на хирургическое воздействие atlanto-затылочной дурфальной мембраны, охватывающей цистерну магны, после тупого вскрытия наложения мышц шеи. Однако, в отличие от других процедур, мы рекомендуем использовать иглу, согнутую на кончике, которая может быть стабилизирована против затылочной кости во время введения. Это предотвратит риск проникновения иглы слишком глубоко и повреждения основного мозжечка и медуллы.
Эта хирургическая процедура совместима с исследованиями отслеживания линий, которые направлены на отображение изменений в идентичности клеток и маршрутах миграции через паранхимальные слои. Он также может быть адаптирован к генетическим исследованиям абляции, которые намерены зондировать роль лептоменингеальных клеток в здоровье и болезни, такие как их вклад в корковое развитие5 или распространение бактериального менингита3,11. Наконец, он может быть использован для отслеживания движения спинномозговой жидкости в сочетании с доставкой флуоресцентных трассаторов у диких животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, изложенный здесь представляет собой простую и воспроизводимую процедуру для обозначения лептоменингеальных клеток для картирования судьбы. Мы используем инрасистскую инъекцию эндоксифена, активного метаболита тамоксифена, чтобы вызвать выражение флуоресцентного репорте…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Шведского научного совета, Шведского онкологического общества, Шведского фонда стратегических исследований, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse и Программы стратегических исследований в области стволовых клеток и регенеративной медицины Каролинского института (StratRegen).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
Referenzen
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
