P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

Summary

Descrevemos um protocolo para um modelo tridimensional de co-cultura de vias aéreas infectadas, usando CFBE41o^– células, macrófagos THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, estabelecido na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma nova plataforma para testar simultaneamente a eficácia dos antibióticos, a função da barreira epitelial e marcadores inflamatórios.

Abstract

A pesquisa de fDrug para o tratamento de infecções pulmonares está progredindo para modelos in vitro preditivos de alta complexidade. A presença multifacetada de bactérias em modelos pulmonares pode retransformar o arranjo epitelial, enquanto as células imunes coordenam uma resposta inflamatória contra as bactérias no microambiente. Embora os modelos in vivo tenham sido a escolha para testar novos anti-infecciosos no contexto da fibrose cística, eles ainda não imitam com precisão as condições in vivo de tais doenças em humanos e os desfechos do tratamento. Modelos in vitro complexos das vias aéreas infectadas com base em células humanas (epiteliais brônquicais e macrófagos) e patógenos relevantes poderiam preencher essa lacuna e facilitar a tradução de novos anti-infecciosos para a clínica. Para tais efeitos, foi estabelecido um modelo de co-cultura da linha de células epiteliais antelásticas císticas humanas CFBE41o^– e macrófagos derivados do monócito THP-1, imitando uma infecção da mucosa brônquica humana por P. aeruginosa em condições de interface ar-líquido (ALI). Este modelo é configurado em sete dias, e os seguintes parâmetros são avaliados simultaneamente: integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófago, sobrevida bacteriana e inflamação. O presente protocolo descreve um sistema robusto e reprodutível para avaliar a eficácia da droga e respostas do hospedeiro que poderiam ser relevantes para a descoberta de novos anti-infecciosos e a otimização de sua entrega de aerossol para os pulmões.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno relevante na fibrose cística (CF) que contribui para o comprometimento do tecido pulmonar¹. A produção de polissacarídeos, como alginato e outros exopolídeos mucoides, coordena o progresso da doença, que leva à tenaz adesão bacteriana, limita a entrega de antibióticos a bactérias e protege as bactérias contra o sistema imunológico hospedeiro². A transição da P. aeruginosa da fase planctônica para a formação de biofilmes é uma questão crítica nesse contexto, facilitando também a ocorrência de tolerância a antibióticos.

No contexto da CF, o mouse tem sido usado principalmente como modelo. Os camundongos, no entanto, não desenvolvem espontaneamente essa doença com a introdução de mutações CF³. A maioria dos estudos de desenvolvimento de biofilme bacteriano e suscetibilidade a medicamentos tem sido realizada em superfícies abióticas, como placas de Petri. No entanto, essa abordagem não representa a complexidade in vivo. Por exemplo, importantes barreiras biológicas estão ausentes, incluindo células imunes, bem como o epitélio mucosa. Embora p. aeruginosa seja bastante tóxica para células epiteliais, alguns grupos conseguiram co-cultivar um biofilme P. aeruginosa anterior com células brônquicas humanas. Essas células originaram-se de pacientes com fibrose cística com mutação CFTR (CFBE41o^– células)⁴ e permitiram avaliar a eficácia do antibiótico⁵ ou avaliar a correção da proteína CFTR durante a infecção⁶. Tal modelo mostrou-se para melhorar a previsibilidade da eficácia da droga, além de possibilitar a caracterização de problemas com drogas que falharam em fases posteriores do desenvolvimento de medicamentos⁷.

No entanto, no pulmão, o epitélio mucosa é exposto ao ar. Além disso, as células imunes presentes nas vias aéreas, como macrófagos teciduais, desempenham um papel essencial contra patógenos ou partículas inaladas⁸. Macrófagos migram através das diferentes camadas celulares para alcançar o lúmen brônquico e combater a infecção. Além disso, as drogas inaladas também têm que lidar com a presença de muco como um elemento não celular adicional da barreira ar-sangue pulmonar⁹. De fato, vários modelos in vitro tridimensionais complexos (3D) foram desenvolvidos, com o objetivo de aumentar a relevância in vivo. Sistemas de co-cultura não só aumentam a complexidade de sistemas in vitro para descoberta de drogas, mas também permitem estudar interações célula-células. Tal complexidade tem sido abordada em estudos sobre a migração de macrófagos¹⁰, a liberação de peptídeos antimicrobianos por neutrófilos¹¹, o papel do muco na infecção⁹, e a reação das células epiteliais ao dano excessivo¹². No entanto, um modelo in vitro infectado por CF confiável que apresenta a mutação genética em CF, que é exposto ao ar (aumento da condição fisiológica), e integra as células imunes ainda está em falta.

Para preencher essa lacuna, descrevemos um protocolo para a co-cultura 3D humana estável das vias aéreas infectadas. O modelo é constituído por células epiteliais e macrófagos bronquiais humanos, infectados com P. aeruginosa e capazes de representar uma barreira difuso e imunológica. Com o objetivo de testar anti-infecciosos a uma taxa razoavelmente alta, esta co-cultura foi estabelecida na membrana de filtro permeável de pastilhas de placas de poço, utilizando duas linhas de células humanas: CFBE41o^– e macrófagos derivados de monócitos THP-1. Além disso, para eventualmente estudar a deposição de anti-infecciosos aerossolizados^13,o modelo foi estabelecido na interface ar-líquido (ALI) em vez de condições cobertas líquidas (LCC).

Como relatamos aqui, este modelo permite avaliar não apenas a sobrevivência bacteriana em um tratamento antibiótico, mas também citotoxicidade celular, integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos e respostas inflamatórias, que são parâmetros essenciais para o desenvolvimento de medicamentos.

Este protocolo combina dois tipos de células relevantes para a terapia de inalação das vias aéreas pulmonares: macrófagos e epitélio bronquial cf. Essas células são semeadas em lados opostos de pastilhas de suporte permeáveis, permitindo a exposição celular ao ar (chamada de interface ar-líquido (ALI). Esta co-cultura de células hospedeiras é subsequentemente infectada com P. aeruginosa. Ambas as linhas celulares hospedeiras são de origem humana: as células epiteliais representam o epitélio brônquico da fibrose cística, com uma mutação no canal CF (CFBE41o^–), e as células THP-1¹⁴ são uma linha celular bem caracterizada como macrófago. Uma camada epitelial confluente é permitida pela primeira vez para se formar no lado superior das pastilhas de placas de poço antes que as células semelhantes ao macrófago sejam adicionadas ao compartimento oposto. Uma vez que a co-cultura é estabelecida na ALI, o sistema é inoculado com P. aeruginosa no lado apical. Este sistema de cocultura infectado é então usado para avaliar a eficácia de um antibiótico, por exemplo, tobramicina. São analisados os seguintes pontos finais: integridade da barreira epitelial em termos de resistência elétrica transepitelial (TEER), visualização de interações célula-célula-célula-célula-bactérias por microscopia de varredura a laser confocal (CLSM), sobrevivência bacteriana por contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), sobrevivência celular hospedeira (citotoxicidade) e liberação de citocinas.

Protocol

1. Crescimento e diferenciação de células em pastilhas de suporte permeáveis Cultivar CFBE41o- em um frasco T75 com 13 mL de meio essencial mínimo (MEM) contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% aminoácidos não essenciais e 600 mg/L de glicose a 37 °C com atmosfera de 5 % de CO2. Adicione meio fresco às células a cada 2 a 3 dias. Retire as células após atingir 70% de confluência no frasco com 3 mL de trippsina- ácido edenediaminetetraacético (EDTA) a 37°C por …

Representative Results

A Figura 1A mostra a morfologia da co-cultura resultante das células epiteliais e macrófagos brônquicos humanos depois de crescer tanto por 24 h no lado apical e basolateral de suportes permeáveis, respectivamente. A integridade da barreira epitelial é mostrada por TEER (834 Ω×cm2) e CLSM por imunostaining para a proteína de junção apertada ZO-1 (Figura 1B). Os mesmos resultados observados em termos de integridade de barreira de CFBE41o não…

Discussion

Este artigo descreve um protocolo para uma cocultura 3D das vias aéreas infectadas, constituída pela linha de células epiteliais anfíquiis císticas humanas CFBE41o- e a linha de células macrófagos derivadas do monocito humano THP-1. O protocolo permite a avaliação da integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos, sobrevivência de bactérias e inflamação, que são parâmetros importantes ao testar a eficácia da droga e as respostas do hospedeiro simultaneamente. A novidade no modelo está …

Materials

Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	–
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o– cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754