הפרוטוקול המוצג מתאר את ההובלה וההכנה של רקמת היפוקמפוס אנושית חתוכה במטרה האולטימטיבית להשתמש פרוסות מוח חיוניות ככלי הערכה פרה-קרטילי עבור חומרים אנטי אפילפטיים פוטנציאליים.
אפילפסיה משפיעה על כ-1% מאוכלוסיית העולם ומובילה לירידה חמורה באיכות החיים בשל התקפים מתמשכים, כמו גם סיכון גבוה למוות פתאומי. למרות שפע של אפשרויות טיפול זמינות, כ-30% מהחולים עמידים לתרופות. מספר טיפולים חדשניים פותחו באמצעות מודלים של בעלי חיים, אם כי שיעור החולים עמידים לתרופות נשאר ללא לא מום. אחת הסיבות הסבירות היא היעדר תרגום בין מודלים מכרסמים ובני אדם, כגון ייצוג חלש של סיוע פרמקומרים אנושיים במודלים של בעלי חיים. רקמת מוח אנושית חיתוך ככלי הערכה פרה-לקלינלית יש את היתרון לגשר על פער תרגום זה. מתואר כאן היא שיטה להכנת באיכות גבוהה של פרוסות מוח היפוקמפוס אנושי אינדוקציה יציבה לאחר מכן של פעילות אפילפטיפורם. הפרוטוקול מתאר אינדוקציה של פעילות פרץ במהלך יישום של 8 mM KCl ו 4-aminopyridin. פעילות זו רגישה ל-AED לקוסמיד מבוסס או למועמדים אנטי-אפילפטיים חדשניים, כגון דימתילתנולמין (DMEA). בנוסף, השיטה מתארת אינדוקציה של אירועים דמויי התקף CA1 של פרוסות מוח היפוקמפוס אנושי על ידי הפחתה של Mg חוץ תאי2+ ויישום של bicuculline,חוסם קולטן GABA. ניתן להשתמש בהגדרה ניסיונית כדי לסנן חומרים אנטי אפילפטיים פוטנציאליים להשפעותיהם על פעילות אפילפטיפורמה. יתר על כן, ניתן לאמת מנגנוני פעולה עבור תרכובות ספציפיות באמצעות גישה זו ברקמה אנושית (למשל, באמצעות הקלטות מדבקות). לסיכום, חקירה של רקמת מוח אנושית חיונית ex vivo (כאן, היפוקמפוס נותח מחולים הסובלים מאפילפסיה של האונה הרקתית) ישפר את הידע הנוכחי של מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים במוח האנושי.
אפילפסיה היא אחת ההפרעות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר, המשפיעה על 1% מאוכלוסיית העולם, והיא קשורה לתחלואה מוגברת ותמותה1,2. למרבה הצער, שליש מהחולים הסובלים מאפילפסיה עמידים לתרופות, למרות שפע של אפשרויות טיפול זמינות כולל יותר מ 20 תרופות אנטי אפילפטיות מאושרות (AEDs)3. כישלון לתרגם תוצאות ממחקר פרה-קליני בבעלי חיים לניסויים קליניים היא אחת הסיבות מדוע אסטרטגיות טיפול מבטיח אינן יעילות בחולים רבים4. לאחרונה, neuropeptide Y (NPY) ו galanin הראו יש השפעות אנטי אפילפטיות במודלים של בעלי חיים; למרות, כאשר נבדק רקמת מוח אנושית לקטוע, רק NPY היה יעיל5.
רוב הידע הקיים בנוגע למנגנונים נוירולוגיים בסיסיים וגישות לטיפול במחלות נובע ממודלים של בעלי חיים ומניסויים בתרבות התאים. למרות אינפורמטיבי, מודלים אלה מייצגים רק היבטים בודדים של מחלות אנושיות מורכבות ואת רשת המוח האנושית הבוגרת. לחלופין, רקמת המוח האנושית יש פוטנציאל לגשר על הפער התרגום, אבל הוא זמין לעתים נדירות עבור מחקרים פונקציונליים. לדוגמה, רקמת המוח שלאחר המוות כבר כלי רב ערך בחקירת ביטוי חלבון, מורפולוגיה במוח, או קשרים אנטומיים, למרות פעילות עצבית היא לעתים קרובותבסכנה היא רקמה זו 6,,7,,8,9,,10,,11.
לעומת זאת, רקמת המוח האנושית החיים נותעה נחקרה בנוגע להערכת תרופות פרה-לקלינליות, פונקציות עצביות בסיסיותודפוסי ביטוי גנים 12,,13,,14,,15,,16,,17. יתרון גדול של פרוסות מוח אנושיות בהשוואה פרוסות מכרסמים היא הכדאיות הארוכה של רקמה עצבית לאחר ניתוח והכנה. בהשוואה פרוסות מוח מכרסמים, אשר ניתן להקליט בדרך כלל עד 8 שעות לאחר ההכנה, פרוסות המוח האנושי להראות פעילות עצבית יציבה עד 72 שעות, המאפשר חקירה יסודית של דגימות נדירות ויקרותאלה 12,,18.
מספר מחקרים חקרו תכונות של פעילות אפילפטיפורמה בתחומים שונים של רקמת אדם קליפתית והיפוקמפוס נותח והשתמשו בשיטות שונות עבור אינדוקציה של פעילות אפילפטיפורמה. בפרוסות מכרסמים, פעילות אפילפטיפורם יכולה להיות מושרה על ידי מספר שיטות: גירוי חשמלי של תאי DG hilar, עלייה של K חוץ תאי+ (8-12 mM KCl), חסימה של קולטני GABAA על ידי bicuculline (BIC), חסימת ערוצי אשלגן על ידי 4-aminopyridine (4-AP), והסרה או צמצום מ”ג2+ בתמיסהחוץ תאית 19. עם זאת, אינדוקציה של פעילות אפילפטיפורמה ברקמה האנושית דורשת שילוב של לפחות שתיים מהשיטות הנ”ל20,21,22.
מוצג כאן היא שיטה להכנת פרוסות מוח היפוקמפוס אנושי, אשר קיימא עבור עד 20 שעות ולהראות אינדוקציה של פעילות אפילפטיפורמה על יישום של Kגבוה + (8 mM) ו 4-AP או נמוך Mg2+ ו BIC.
רקמת מוח אנושית ונקטויה חיה היא כלי בעל ערך רב בהערכה פרה-קולינית של AEDs, כפי שהוא מייצג כראוי מיקרו-רשת של המוח האנושי שלם. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה להובלת רקמות והכנה, אשר מבטיחה פרוסות היפוקמפוס באיכות גבוהה, כמו גם שיטת אינדוקציה יציבה עבור פעילות אפילפטיפורמה קריטית להערכת AED.
חקירה של פעילות אפילפטיפורמים, כמו גם שיטות אינדוקציה כימית או חשמלית בפרוסות מוח אנושי הוצגו בעבר על ידי קבוצותאחרות 17,20,21,22. פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה של פעילות פרץ יציבה בפרוסות מחולים שונים באמצעות יישום של Kגבוה ++4-AP, כמו גם אינדוקציה של SLEs באזור CA1 באמצעות יישום של Mgנמוך 2++BIC. נמצא כי האינדוקציה של פעילות פרץ היא עקבית יותר (80% של פרוסות שנבדקו ב 15 חולים) מאשר אינדוקציה של SLEs (50% של פרוסות שנבדקו בחולה אחד). עם זאת, עד כה, האינדוקציה של SLEs כבר רק נבחן בחולה אחד. אף על פי כן, אינדוקציה של SLEs על ידי נמוךMg 2++BIC מומלץ, כמו SLEs עדיין לא הצליח להיות מושרה באמצעות Kגבוה ++4-AP.
מספר מחקרים הציגו שיטות להובלה והכנה של רקמת המוח האנושית ולעתים קרובות מדגישים שלושה גורמים קריטיים להישרדות עצבית: זמן הובלה, פתרונות תחבורה משומשים, ותנאי אחסון.
עבור הכדאיות פרוסה אופטימלית, כמה קבוצות מציעות כי ההובלה של רקמת מוח חתוכה להיות קצר ככל האפשר. עם זאת, חדרי ניתוח ומעבדות נמצאים לעתים נדירות בסמיכות, כלומר איכות הפרוסה עלולה להיות בסכנה עקב תחבורה ארוכה. קבוצות מסוימות התגברו על מכשול זה על ידי החלת O2 קבוע לפתרון במהלךתחבורה 12. הובלנו רקמת מוח בקיצור (מקסימום = 15 דקות) ותקופות ארוכות (עד 1 שעות) של זמן ללא אספקה קבועה נוספת O2 במהלך ההובלה, בדומה לקבוצותאחרות 18,25. במקרים אלה, הבדלים באיכות הרקמה לא נצפו במהלך הקלטות אפילפטיפורמה. בתקשורת עם קבוצות אחרות במכון שלנו, איכות הפרוסה לא משתנה גם לניסויים במלחציים. לעומת זאת, שונות באיכות הרקמה נובעת אולי מנזק במהלך פעולות, ניתוח ממושך והליך חיתוך.
לגבי פתרון תחבורה וחיתוך, כל השיטות שפורסמו להשמיט NaCl מפתרונות כדי להפחית את נפיחות התא בשל לחץ אוסמוטי, בדומה להליך הסטנדרטי לניסויים תיקון-מהדק מכרסמים. עם זאת, מספר תחליפים הוצגו עד כה (כלומר, aCSF13מבוסססוכרוז ,22, ACSF12מבוסס NMDG,26, ו aCSF מבוסס כולין27). דינג ועמיתיו הציגו את aCSF מבוסס NMDG להכנת פרוסה ב 201426 ומאוחר יותר הוסיף פרוטוקול שחזור, אשר לאט לאט מציג מחדש NaCl לפרוסות28. עם זאת, כפי שתואר על ידי Ting et al., נוירונים של רקמת המוח שהוכנו aCSF מבוסס NMDG להראות עמידות קרום גבוה יותר, ובכך להשפיע על אטם תאים שלמיםבמהלך ניסויים תיקון-מהדק 26. לכן, עברנו מ- aCSF מבוסס NMDG לשימוש aCSF20מבוסס כולין , אשר מניב פרוסות באיכות גבוהה עבור פוטנציאל השדה והקלטות תיקון-clamp.
לגבי אחסון של פרוסות, מקובל כי תנאי ממשק לספק חמצון אופטימלי קריטי להישרדות פרוסה ארוכה18. עם זאת, קבוצות אחרות להראות הישרדות פרוסה עד 72 שעות בתנאיםשקועים 12. בניגוד להשערה קודמת, פרוסות מוח אנושי נראה עמיד יותר חמצון נמוך או סטרס חמצוני בהשוואה פרוסות מכרסמים. בעיקר, תאי ממשק שימשו בעבר לאחסון של פרוסות היפוקמפוס אנושי, למרות תנאים שקועים מומלצים לתחזוקה של פרוסות מוח אנושיות בניסויים מדבקה מהדק.
כפי שנדונו על ידי קבוצות אחרות, צעד קריטי נוסף להישרדות פרוסה ארוכה (ממשק עבור <48 שעות18, שקוע עבור <72 h12)הוא מניעת זיהום חיידקי. פרוסות מוח מכרסמים משמשים בדרך כלל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות עד 8 שעות, זיהום חיידקי אינו נחשב להשפיע על הכדאיות פרוסה בתקופה זו. מספר גבוה של פרוסות שהוכנו מחתך אחד והזמינות הנדירה של רקמת המוח האנושית מדגיש את הצורך להאריך את הכדאיות של פרוסות מוח אנושיות. שיטה זו מתארת בהצלחה את הכנת פרוסות מוח היפוקמפוס אנושיות חיים, אשר ניתן להתאים בקלות לתנאים סטריליים. עם זאת, עבור ההקלטות שבוצעו כאן, הישרדות פרוסה המשתרעת על פני 20 שעות לא הייתה בראש סדר העדיפויות.
הקלטה בחדרי ממשק גם הוכח כחיוני עבור אינדוקציה של פעילות אפילפטיפורמה כגון SLEs22. תנאים שקועים, בשל חמצון נמוך, משמשים לעתים נדירות להקלטה של SLEs; עם זאת, הם נחוצים עבור רזולוציה גבוהה אופטית הדרושה לניסויים תיקון-מהדק. השימוש בתא הקלטה מסוג שקוע ממוטב מאפשר הקלטה של פעילות אפילפטיפורמה (שדה חוץ תאי או נוירון יחיד) בפרוסות מוח אנושיות, בשל חמצון גבוה ויישום תרופהמהירה 29. כאן מתוארות שיטות ותוצאות עבור הקלטות פוטנציאליות בשטח, אך יש להדגיש כי הקלטות של תיקון-מהדק בוצעו בהצלחה בפרוסות עכבר ומוח אנושי באמצעות תא הקלטה זה ששונה (הנתונים אינם מוצגים).
רקמת מוח אנושית לקטוע יש ערך תרגום גבוה יותר בהשוואה למודלים מכרסמים. הוא מייצג רשת עצבית בוגרת וחלויה שלא ניתן לשכפל על ידי iPSCs. עם זאת, כמו בכל מערכת במבחנה, פרוסות מוח אנושי אינן מייצגות מוח אנושי שלם. בנוסף, הרשתות העצביות המוקלטות של רקמת המוח הקטע יכול לעבור שינויים מולקולריים ופונקציונליים משמעותיים עקב נזק במהלך פעולה או הכנה. הליכי חיתוך הראו להשפיע על תפקוד GABAergic עשוי להשפיע על האינדוקציה של פעילות אפילפטיפורמה30. יש לשקול מגבלות אלה בעת גיבוש השערה. בעת בדיקת תרופות אנטי אפילפטיות פוטנציאליות, יש לקחת בחשבון את השימוש באזורים שונים במוח, כמו מטרות סמים לא יכול לבוא לידי ביטוי בכל אזורי המוח האנושי או כל החולים. בפרט, ההיפוקמפוס של חולי TLE לעתים קרובות להראות סימנים של טרשת היפוקמפוס מלווה באובדן תאים עצביים חמורים. מומלץ לקבל מידע על המטופל על שינויים פתולוגיים והיסטוריה של מחלות, כגון אפשרות בעיה כלפי תרופות, ולשקול זאת במהלך פרשנות נתונים.
לסיכום, שיטה זו מתארת בהצלחה את הכנת פרוסות מוח היפוקמפוס אנושיות חיים וטכניקות אינדוקציה להקלטת שני סוגים שונים של פעילות אפילפטיפורם. מאז הזמינות של רקמת מוח אנושית חיה היא נדירה, תנאי תחבורה והקלטה אופטימיזציה יש להשתמש כדי להבטיח פלט מרבי מניסויים באמצעות פרוסות מוח אנושיות. הוא הציע כי רקמת המוח האנושי ים ניתן להשתמש ככלי אימות פרה-לקלינלי בנוסף מודלים מכרסמים וניסויים תרבות התא.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למנדי Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, ברלין) על סיוע טכני מעולה. P.F. מומן על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG, דויטשה Forschungsgemeinschaft) תחת אסטרטגיית מצוינות של גרמניה-EXC-2049-390688087. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז QUEST לשינוי מחקר ביו רפואי במכון הבריאות של ברלין.
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |