Цель состоит в том, чтобы дробить и изолировать биологически активные мелкие молекулы, пептиды из сложного растительного экстракта и белки из патогенных микробов, используя жидко-фазный изоэлектрический метод фокусировки (IEF). Кроме того, были идентифицированы разделенные молекулы и подтверждена их биоактивность.
Натуральные продукты, полученные из растений и микробов, являются богатым источником биологически активных молекул. Перед их использованием активные молекулы из сложных экстрактов должны быть очищены для применения ниже по течению. Существуют различные хроматографические методы, доступные для этой цели, но не все лаборатории могут позволить себе методы высокой производительности и изоляции от сложных биологических образцов может быть трудно. Здесь мы демонстрируем, что preparative liquid-phase isoelectric focusing (IEF) может отделять молекулы, в том числе небольшие молекулы и пептиды из сложных растительных экстрактов, на основе их изоэлектрических точек (pI). Мы использовали метод для сложной фракционации и характеристики биологических образцов. В качестве доказательства концепции, мы дроболовый экстракт Гимнема сильвестр растений, изолируя семейство терпеноидных сапонин малых молекул и пептид. Мы также продемонстрировали эффективное разделение микробного белка с использованием грибка Candida Albicans в качестве модели системы.
Очистка биомолекулы из сложных биологических образцов является важным и часто трудным шагом в биологических экспериментах1. Изоэлектрическая фокусировка (IEF) хорошо подходит для разделения высокого разрешения сложных биомолекул, где несущая амфолиты путешествуют в соответствии с их зарядом и устанавливают градиент рН в электрическом поле3. Первый коммерческий авиаперевозчик для IEF был разработан Улофом Вестербергом в 1964 году и запатентовал4,5. Перевозчик амфолиты алифатические олиго-амино олиго-карбокслихиловой кислоты молекул различной длины и ветвящихся6. Впоследствии Вестерберг и другие улучшили перевозчик амфолитов для их расширенного использования в разделении биомолекул6,7.
Методы разделения биомолекул включают агарозу и полиакриламинид гель электрофорез, двухмерный гель электрофорез (2-DE), изоэлектрической фокусировки, капиллярный электрофорез, изотахофорез и другие хроматографические методы (например, TLC, FPLC, HPLC)2. Ликвид-фазный IEF, выполненный в инструменте под названием “Rotofor”, был изобретен Миланом Биром8. Он был инициатором концепции и дизайна этого инструмента и внес значительный вклад в теорию электрофоретической миграции. Его команда также разработала математическую модель электрофоретического процесса разделения для компьютерного моделирования9.
Аппарат IEF-фазы является горизонтально вращающейся цилиндрической ячейкой, состоящей из нейлонового ядра, разделенного на 20 пористых отсеков и циркулирующего керамического стержня для охлаждения воды. Пористие камеры позволяют молекулам мигрировать через аквеи между электродами и позволяют сбор очищенных образцов под вакуумом в фракциях. Эта система очистки может обеспечить до 1000-кратное очищение конкретной молекулы в Зтт;4 часа. Ценной особенностью этого инструмента является то, что он может быть применен в качестве первого шага для очистки от сложной смеси или в качестве заключительного шага для достижения чистоты10. Если молекулой интереса является белок, еще одним преимуществом является то, что его родная конформация будет поддерживаться во время разделения.
Использование жидко-фазы IEF было широко сообщено для белков, ферментов и очищения антител6,,10,,11,12,13,14. Здесь мы описываем использование этого подхода для разделения и очистки малых молекул и пептидов от лекарственного растения Gymnema sylvestre. Этот протокол поможет исследователям сконцентрировать и очистить активные малые молекулы из растительного экстракта для приложений ниже по течению по низкой цене. Кроме того, мы также демонстрируем, что обогащение белков из сложного белкового экстракта из гриба Candida albicans 15 в этой системе на основе IEF в качестве второго примера.
Небольшие молекулы из натуральных источников продукта (например, растения) включают сложные вторичные метаболиты, которые очень разнообразны в химической структуре. Считается, что они участвуют в механизмах защиты растений. Кроме того, полипептиды также присутствуют в тканях растени?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны за источники финансирования из Отдела биологии и Джонсона онкологический научный центр BRIEF и ИРА награды, соответственно, GV. Мы также благодарим K-INBRE постдокторской награды Р.В. Эта работа была частично поддержана Премией за институциональное развитие (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под грантовым номером P20 GM103418. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национального института общих медицинских наук или Национальных институтов здравоохранения. Мы благодарим анонимных рецензентов за их полезные комментарии.
0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
Incubator | Lab companion | SI 300R | |
Microscope | Leica | DM 6B | |
Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |