תרבות של פריציטים נומי מוח למדידות סידן ציטוסולית מחקרי הדמיית סידן

Summary

pericytes נימי המוח הם שחקנים חיוניים ברגולציה של תכונות מחסום דם – מוח וזרימת דם. פרוטוקול זה מתאר כיצד pericytes נימות המוח יכול להיות מבודד, תרבותי, מאופיין ביחס לסוג התא והגיש בקשה לחקירות של סידן תאי איתות עם בדיקות פלורסנט.

Abstract

Pericytes קשורים עם תאים אנדותל ו endfeet אסטרוציטים במבנה המכונה היחידה הנוירוסקולרית (NVU). תפקוד פריציט נמת המוח אינו ידוע במלואו. Pericytes הוצעו להיות מעורבים בפיתוח נימי, רגולציה של מחסום אנדותל ופעילות trancytosis, רגולציה של טון נימי ולשחק תפקידים מכריעים בפתולוגיות מוח מסוימות.

Pericytes מאתגרים לחקור במוח שלם בשל הקשיים בהדמיה תהליכים parenchyma במוח, כמו גם את הקרבה לתאים האחרים של NVU. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד ותרבות של pericytes נימות המוח הראשי של המוח של פר והשימוש הבא שלהם במחקרי הדמיית סידן, שבו ניתן לחקור השפעות של אגוניסטים המעורבים איתות מוחי ופתולוגיות. שברי נימים קליפתיים מותר לצרף לתחתית מבחנות תרבות, ולאחר 6 ימים, תאים אנדותל וpericytes גדלו מתוך שברי נימים. תאי אנדותל מוסרים על ידי טריפסינוזציה עדינה pericytes הם תרבותיים במשך 5 ימים נוספים לפני המעבר.

pericytes מבודד נזרעים 96-well צלחות תרבות טעון עם צבע מחוון סידן (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) כדי לאפשר מדידות של רמות סידן תאי בהגדרת קורא צלחת. לחלופין, pericytes הם זרעים על כיסויים רכוב בתאי תא. לאחר טעינה עם מחוון הסידן (Cal-520 AM), סידן חי הדמיה יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופ confocal באורך גל העירור של 488 nm ואורך גל פליטה של 510-520 נה”מ.

השיטה המתוארת כאן שימשה כדי להשיג את מדידות סידן תאי הראשון מpericytes המוח הראשי, המוכיח כי pericytes מגורה באמצעות ATP והם מסוגלים להתכווץ במבחנה.

Introduction

פריציטים נימי המוח, יחד עם תאים אנדותל ואסטרוציטים, מהווים NVU^1,2,3. תאי אנדותל, אשר מהווים את הבסיס המבני של הנימים, יוצרים צינורות גליליים ארוכים בקוטר של 5-8 μm. תאי ה אנדותל מכוסים באופן אקראי בpericytes ומוקפים בולטות של אסטרוקיטים; כפות החיים של האסטרוציט.

מחסום הדם – מוח (BBB), ממוקם נימים במוח, הוא האתר העיקרי להחלפת חומרים מזינים, גזים ומוצרי פסולת בין המוח והדם. BBB גם מגן על המוח מפני רעלנים עצביים אנדוגניים אקסוגניים ומשמש כמחסום למסירה של מספר רב של תרכובות סמים. פונקציית המחסום היא אזור מיקוד, כמו גם מכשול, עבור חברות תרופות המפתחות תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). זה עורר עניין רב בחקירת התאים של NVU בתרבות⁴. אסטרוקטים במוח ותאי אנדותל כבר תרבותיים ומאופיין במספר מחקרים, בעוד המחקרים והפרוטוקולים לתרבות pericyte הם שונים.

פרוטוקולים שפורסמו בעבר תיארו דור של תרבויות פריציט נימו המוח במידה מסוימת, באמצעות מגוון של גישות שונות כגון אימונופנינג⁵, מדיה גבוהה ונלוכה גלוקוז⁶, פלואורסצנט מופעל תא^{מיון 7}, צנטריפוגה^{הדרגתית צפיפות 8}, וכו ‘. למרות ששיטות אלה נראות מספיקות כדי להשיג תרבויות של פריציטים, חלקן גוזלות זמן, בעלות יקרה והפריקיטים שהושגו לא יהיו אידיאליים בשל מספר מעברי התרבות שיכולים להבדיל בין ה pericytes⁹. יתר על כן, הפוטנציאל של pericytes מתורא במבחנה איתות מחקרים כבר די לא נחקר עד עכשיו.

העבודה הנוכחית מתמקדת בדור של תרביות פריציט מנימים מבודדים של מוח בקר וההגדרה הבאה למדידות ולחקרי הדמיה של שינויים בסידן תאי, שליח שני תאי חשוב. אנו מתארים בקצרה את הבידוד של נימים מחמר אפור קליפתי (לפרטים ראו הלמס ואח’¹⁰⁾ואת הבידוד והתרבות של pericytes במונוקולטורה טהורה ללא זיהום עם תאים אנדותל או גליה. לאחר מכן אנו מספקים פרוטוקול ל זריעת pericytes ב 96-באר צלחות וטעינת פרוטוקולים עבור גשושית סידן Fura-2 AM. לבסוף, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בפריציטים בהדמיה קונפוקלית בזמן אמת בחדרי תרבות מיקרוסקופ ומתארים את הפרוטוקולים לכך.

Protocol

1. הכנת מאגרים ופתרונות לקליטת תאים להכין פתרון מלאי קולגן על ידי המסת 5 מ”ג קולגן הרביעי מהשיה האנושית ב 50 מ”ל של PBS לילה ב 4 ° C. Aliquot פתרון המניות לתוך 5 מ”ל מנות ולאחסן ב -20 ° C. להכין פתרון מלאי פיברונקטין על ידי המסת 5 מ”ג של פיברונקטין ב 5 מ”ל של מים סטריליים בן לילה. לאחסן את מניות פיב…

Representative Results

נימים במוח של פר בודדו רקמת מוח טרייה ואיור 1 מציג את זריעת הנימים ואת ההתגלות התאית במשך ימים וטיהור של pericytes לאחר מכן. הנימים מחוברים באופן מלא לנבון ביום הראשון וביום השני נבט אנדותל הפך גלוי(איור 1,יום 2). לאחר 4 ימים, ההתגלות הסלולרית היא ?…

Discussion

במחקר זה, אנו הציגו שיטה לבודד pericytes ראשוני ממוחות של קבר. הפרוטוקול המתואר מאפשר תרבות מסוג תא זה, שאחרת אינו נגיש. תרבות התא שהושגה לאחר מכן הייתה אוכלוסייה כמעט הומוגנית של pericytes, עם זיהום קטן או ללא עם תאים אנדותל ותאי גליה המבוססים על מורפולוגיה של תאים וביטוי^{חלבון 12}. יתר על…

Materials

ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22×22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603