JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050’nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

Abstract

M42 aminopeptidazlar 12 alt birimden oluşan fonksiyonel olarak aktif kompleksler oluştururlar. Montaj süreci, dimer-dodecamer geçişini tetikleyen metal iyon kofaktörleri tarafından düzenleniyor gibi görünüyor. Metal iyon bağlama üzerine, aktif sitede ve etkileşim arabiriminde çeşitli yapısal değişiklikler meydana gelir ve dimerleri kendi kendini birleştirmeyi teşvik etmek için şekillendirir. Bu tür değişiklikleri gözlemlemek için, kararlı oligomerler yapısal çalışma dan önce izole edilmelidir. Burada bildirilen tmPep1050 kararlı dodecamers ve dimers arınma sağlayan bir yöntemdir, T. maritimabir M42 aminopeptidaz , ve X-ışını kristalografisi ile yapı tayini. Dimers bir şelat ajanı ile metal iyonları kaldırarak dodecamers hazırlanmıştır. Onların cofactor olmadan, dodecamers daha az kararlı oldu ve tamamen ısıtma üzerine ayrıştı. Oligomerik yapılar basit moleküler değiştirme yaklaşımı ile çözüldü. Metodolojiyi göstermek için, metal iyon bağlama da tamamen bozulmuş bir TmPep1050 varyantının yapısı, monomerler için dimerlerin daha fazla dökümünü göstermeden sunulmuştur.

Introduction

Oligomerizasyon birçok proteinin biyolojik fonksiyonlarını belirleyen baskın bir süreçtir. Escherichia coli’deproteinlerin sadece %35’inin monomerik1olduğu tahmin edilmektedir. Morfin adı verilen bazı proteinler, her oligomerik durumda farklı bir yapıya sahip alt birimlere sahip birkaç oligomerik durumu bile benimseyebilir2. Onların oligomerik durumları arasındaki geçiş genellikle her oligomerik devlet farklı bir özel aktivite veya fonksiyon olabilir gibi protein aktivitesini düzenlemek için bir ortalamadır. Çeşitli morfin örnekleri literatürde iyi belgelenmiştir, özellikle porfobilinojen synthase3, HPr kiazaz /fosfataz4, Lon proteaz5, laktat dehidrogenaz6, gliserindehit-3-fosfat dehidrogenaz7, piruvat kiaz8, sitrat synthase9, veribonu10. Son zamanlarda, m42 aminopeptidaz TmPep1050, olan aktivitesi oligomerik devletlere bağlıdır morfin benzeri davranış, enzim başka bir örnek açıklanan11. Oligomerik durumları arasındaki geçiş, alt birimlerin çeşitli yapısal değişikliklerine neden olan metalik kofaktörleri tarafından aracılık edilir.

M42 aminopeptidaz ailesi MH klan12aittir ,13, ve yaygın Bakteri ve Archaea arasında dağıtılır14. M42 aminopeptidazlar, peptidleri 35 amino asit kalıntısına kadar bozan gerçek dinükleer enzimlerdir15. Aktif alanları bir iç kaviteye doğru yönlendirilmiş 12 alt birimden oluşan, tetrahedron şeklinde tuhaf bir yapı benimserler. Böyle bir düzenleme genellikle kontrolsüz proteoziz önlemek için aktivitenin nano-bölümleme olarak tanımlanır. M42 aminopeptidazların fizyolojik fonksiyonu proteozom ile ilişkili olabilir, protein yıkımı sonucu peptidler hidrolize16,17. Pyrococcus horikoshii dört M42 aminopeptidaz, her farklı ama tamamlayıcı özellikleri18sunan sahip,19,20,21. Tekil olarak, alt birimlerin iki farklı türde yapılan heterokompleksler P. horikoshiitarif edilmiştir , peptidasome kompleksleri varlığını düşündüren22,23.

M42 aminopeptidazların çeşitli yapıları literatürde tanımlanmıştır11,16,18,19,20,24,25,26. Alt birim iki farklı etki alanı, bir katalitik etki alanı ve bir dimerization etki alanından oluşur. Katalitik etki alanı tüm MH klan korunmuş ortak bir α / β kat benimser, archetypal katalitik etki Vibrio proteolyticus aminopeptidaz Ap1 vibrio proteolyticus27olmak. Dimerization etki alanı bir PDZ benzeri kat16 benimser ve olabilir, oliomerizasyon rolüne ek olarak, substrat erişim kontrol ve iç boşluğunda bağlama bir rol11. Temel yapı taşı bir dimer olduğu için, dodecamer genellikle altı dimer ilişkisi olarak tanımlanır, her dimer tetrahedron16her kenarında konumlandırılmış olmak. M42 aminopeptidazlarının oliomerizasyonu metal kofaktörlerinin bulunabilirliğine dayanır. Divalent metal iyonları, genellikle Zn2 + ve Co2+,katalitik peptit bağlama ve hidroliz katılır. Onlar iki ayrı bağlama siteleri, yani M1 ve M2 siteleri bulunur. İki metal iyonları da sürücü ve ince PhTET2, PhTET3, PfTET3 ve TmPep105011,24,28,29için gösterildiği gibi oligomerizasyon ayarlayın. Metal kofaktörtü tükendiğinde, dodecamer PhTET2, PhTET3 ve TmPep105011,16,28,hatta monomerler gibi dimers içine demonte, PhTET2 ve PfTET324,29gibi .

Burada sunulan TmPep1050 oligomerlerin yapılarını incelemek için kullanılan bir protokoldür. Bu protokol protein saflaştırma, proteolitik aktivite taraması, kristalizasyon, X-ışını kırınımı ve moleküler replasman gibi ortak yöntemler kümesidir. Metalloenzimlerle başa çıkmanın getirdiği incelikler, protein oligomerizasyonu, protein kristalizasyonu ve moleküler replasman vurgulanır. TmPep1050 dodecamers daha monomerler içine ayrıştırmak ya da olmadığını göstermek için bir çalışma olgusu da sunulmaktadır. Bu soruyu gidermek için, bir TmPep1050 varyantı, TmPep1050H60A H307A, olan metal bağlama siteleri Ala kalıntılar His-60 (M2 site) ve His-307 (M1 site) mutasyona uğratarak bozulur çalışılmıştır. Bu protokol, morfin benzeri davranışlı diğer M42 aminopeptidazları veya metalloenzimleri incelemek için uygun olabilir.

Protocol

1. Rekombinant TmPep1050 üretimi ve arınması NOT: Bundan sonra bir öncekiçalışma1adapte vahşi tip TmPep1050 klonlama prosedürü ve arınma açıklanmıştır. Alternatif olarak, klonlama sentetik bir gen kullanılarak yapılabilir. TmPep1050 varyantları oluşturmak için, site yönelimli mutagenez aşağıdaki yapılabilir, örneğin, paralel protokol tek astar reaksiyonları (SPRINP) yöntemi30. Arınma protokolü TmPep1050 türevleri i?…

Representative Results

TmPep1050 monomerler içine olası bir dodecamer dissociation çalışma için, His-60 ve His-307 kodonlar sentetik bir gen kullanılarak alanin kodon ile değiştirildi. Bu gen daha sonra ifade ve daha sonra TmPep1050H60A H307Aadlı ilgili TmPep1050 varyantı saflaştırma için pBAD vektörklonlandı. Boyut dışlama kromatografisi(Şekil 3B)saflaştırılmış proteinin 56 kDa (monomerin molekül ağırlığı 36.0 kDa) belirgin bir molekül ağırlığına sahip olduğunu gös…

Discussion

Burada açıklanan protokol, TmPep1050’nin yapısal düzeydeki dimer-dodecamer geçişini anlamanızı sağlar. Metodoloji daha önce hem TmPep1050 oligomers11yapısını belirlemek için deneyimli oldu. En zorlu adım, dodecamer’ların istikrarlı dimers’a dönüşmesini teşvik eden koşulları bulmaktı. Bu tür koşullar metal iyon kofaktör eklendiğinde dimers dodecamers içine yeniden birliğini izin vermek için yeterince hafif olması gerekiyordu. Yapısal çalışmaları ve daha fazla bi…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Martine Roovers’a bu yazıyı doğruldurda ve yapıcı yorumlar da yaptığı için teşekkür ederiz. Proxima 2 beamline ‘a (SOLEIL senkrotron) erişim Blok Ayırma Grupları 20151139 içinde ydi.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemie. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. . legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

X-ray CrystallographyOligomeric StateThermotoga MaritimaAminopeptidaseTmPep1050Activity AssayApoenzyme PreparationDialysisUltrafiltration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image