미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석
Summary
이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 – Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.
Abstract
미토콘드리아가 온코겐성 변화에 기여하는 것은 광범위한 관심과 적극적인 연구의 대상입니다. 암 대사 분야가 더욱 복잡해짐에 따라 미토콘드리아 손상(소위 미토칸)을 가하는 다양한 화합물을 이용한 미토콘드리아를 표적으로 하는 것이 매우 인기를 끌고 있습니다. 불행히도, 테트라졸륨 염이나 레사쥐린을 기반으로 하는 것과 같은 많은 기존 세포 독성 작용제는 그들의 성능을 위해 기능적인 미토콘드리아 효소가 필요합니다. 미토콘드리아를 표적으로 하는 화합물에 의해 가해진 손상은 수시로 이 심세의 정확도를 손상합니다. 여기서는 두 개의 형광 염료를 가진 차동 염색에 기초하여 변형된 프로토콜을 설명하고, 그 중 하나는 세포 분산(Hoechst 33342)이고 다른 하나는 그렇지 않다(예의 요오드). 염색의 차이는 살아있는 세포와 죽은 세포를 차별할 수 있게 합니다. 분석법은 처리량을 증가시키고 편견을 감소시키는 자동화된 현미경 검사법과 이미지 분석에 사용가능합니다. 이것은 또한 96 웰 플레이트를 사용하여 고처리량 방식으로 분석방법을 사용할 수 있게 해주며, 특히 문제의 약물이 어느 정도의 미토독성을 가지고 있을 때 약물 발견 노력을 위한 실행 가능한 옵션입니다. 중요하게도, Hoechst/PI 염색 분석체에 의해 얻은 결과는 분석이 다른 방법에 비교될 때 트라이판 블루 배제 결과 및 생물학적 복제 사이에 모두 증가된 일관성을 보여줍니다.
Introduction
효과적인 암 치료를 확인하는 첫 번째 단계는 치료의 효과를 검사하는 데 사용할 수있는 강력하고 편견없는 세포 독성 분석의 선택입니다. 낮은 처리량 실험에 대 한 일반적인 선택은 살아있는 세포에서 trypan 블루 염료의 제외. 이 방법은 세포 생존을 정량화하는 비교적 편견없는 방법을 허용하기 때문에 선호된다. trypan blue는 막이 손상된 세포로 수동적으로 확산되지만 건강한 세포1을입력하는 것이 효과적으로 차단됩니다. 살아있는 세포와 총 세포의 몫은 치료의 효험을 나타내는 백분율 생존력을 나타냅니다. trypan 파란색 분석의 가장 중요한 단점은 높은 처리량 방법론에 적합하지 않다는 것입니다. 그것은 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지고 있으며, 장기간 염색으로 인해 실행 가능한 세포의 얼룩으로 인해 아티팩트를 초래할 수 있습니다. 따라서 trypan 파란색 제외는 일반적으로2이며수동 계수로 강등됩니다. 이것은 너무 느리게 하고 연구원의 주관적인 판단으로 인한 편견의 강한 가능성을 소개합니다 (눈부신 또는 독립적 인 카운트가 사용되지 않는 한 실험실 처리량을 더 줄입니다). 일반적으로, 이 분석의 처리량은 현대 약 발견을 위해 불충분합니다.
일반적으로 훨씬 더 높은 처리량을 가진 생존 가능성 분석은 연구원이 이 한계를 우회할 수 있게 하지만 중요한 주의 사항(표 1참조). 이러한 메서드는 일반적으로 두 그룹으로 나뉩니다. 한 그룹은 세포 레독스 효소의 기능에 기초한 착색 분석으로 구성됩니다. 무색 또는 비형광 기판은 분광광계를 사용하여 정량화 할 수있는 생생한 제품으로 변환됩니다. 테트라졸륨 염(MTT, WST-1, XTT 등)과 레사쥐린등이 대표적인 예입니다. 이 범주에는 또한 ATP 수준을 평가하기 위해 루시페린을 활용하는 발광 성 소사도 포함됩니다. 이 모형의 분석은 세포 대사를 측정하는 근본적인 한계가 있습니다, 이는 세포 생존성이 아닙니다. 세포가 불리한 조건하에서 정지되는 것은 매우 일반적이지만, 여전히3,4,5를분할하는 능력을 유지합니다. 예를 들어, 암줄기세포는 종종 비교적 대사적으로정지6,7,8,9,이러한 기술을 사용하여 분석하기 어려울 가능성이 있다. 대부분의 미토칸과 같은 미토콘드리아 기능을 손상시키는 치료의 효과또한 상당히 과대 평가될 가능성이 높습니다.
다른 방법론은 생물학적 막을 교차하거나 교차하지 않도록 허용하는 다양한 물질의 화학적 특성을 활용합니다. 한 가지 예는 SYTOX 또는 프로피듐 요오드 (PI)와 같은 핵 얼룩입니다. 이 범주에는 또한 개념상 유사하지만 기능상 다른 분석(LDH) 분석, 세포 괴사의 지표로서 세포외 밀리유로LDH의 방출을 측정하는분석(도 1,표 1). 이 소는 신진 대사비활성 세포와 죽은 세포를 구별할 수 있습니다.
| 분석/염료 | 세포 사멸의 유형(들) 검출 | 필요한 장비 | 주요 기능 |
| MTT, CKK-8, 알라마 블루 (레사쥐린) | 아포토시스/괴사증 | 분 광 광도 계 | 저렴, 빠른; 끝점 분석; 효소의 활성 (MTT의 경우 독점적으로 미토콘드리아)에 의존하고 세포 사멸 의 모드를 구별하지 않습니다1,10 |
| LDH 릴리스 | 괴 사 | 분 광 광도 계 | 급속한, 미토콘드리아 효소의 활성과 무관; 높은 처리량 테스트에 대 한 비싼; 결합된 혈장 막11,12를 가진 괴사 세포를 검출합니다 |
| 트라이판 블루 (TB) | 아포토시스/괴사증 | 현미경 | 세포 불굴의; 세포 사멸의 모드를 구별하지 않습니다; 고처리량 스크리닝에 적합하지 않은 고공처리량 스크리닝; 부착 셀과 함께 사용하기가 더 어렵다; 사용자의 주관적인 판단에 취약하지만 표준 셀 생존성 측정방법(13)으로 간주됩니다. |
| 아크리딘 오렌지 (AO) | 아포토시스/괴사/ | 형광 현미경 | 독특한 스펙트럼 특성을 가진 핵산 염료는 세포석증과 괴사/necroptosis14를 구별할 수 있습니다. |
| 네크로토시스 | |||
| 호흐트스트 33342, DAPI | Apoptosis | 형광 현미경 또는 유동 세포계 | 세포 투과성; 세포 사멸을 모니터링하는 것은 그 자체로 부적절합니다. 공동 염색에 유용합니다. 초기 세포사멸에서 크로마틴 응축 및 핵 단편화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 요오드제와 페어링하여 사멸을 괴사15,16과 구별할 수 있습니다. |
| 프로피듐 이오드 (PI) | 늦은 자멸/괴사 | 형광 현미경 또는 유동 세포계 | 세포 불굴의 인터칼레이터; 세포사멸의 후기 세포사멸 및 괴사 모드를 모두검출한다(17). 긴 잠복 시간18 후 독성 및 투과성 |
표 1. 세포 독성 검사 목록. 세포 독성 연구, 일부는이 연구에서 사용 되었다, 그들의 주요 기능에 대 한 간단한 설명과 함께 나열.
최근 연구에 따르면 미토콘드리아 대사가 일부 암19,20,21,22,23,24,25에서변경된다는 것을입증했습니다. 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML)은 그들의 에너지 요구를 충족시키기 위하여 그들의 미토콘드리아 질량, mtDNA 함량 및 미토콘드리아 호흡을 강화시키는 것으로 나타났습니다19,26,27. 한편, 일부 고형종양은 OXPHOS에 관여하는 미토콘드리아 단백질의 다운조절또는 mtDNA 함량 감소와 같은 미토콘드리아 기능 장애 또는 오히려 “대사 재프로그래밍”을 특징으로 하며, 이는 종양 침습성, 전이성 전위 및 세포멸 유발 약물에 대한 내성과 관련이 있다28,29. 더욱이, 최근에는 특정 암에 대한 잠재적 치료법으로 미토콘드리아 기능(일반적으로 미토칸30이라고함)에 영향을 미치는 기계적으로 다양한 화합물을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다. 이들 약물은 ATP 합성, 미토콘드리아 DNA, OXPHOS 및 ROS 생산을 대상으로 하며, 미토콘드리아(30,31)와관련된 세포세포 및 세포세포 단백질을 표적으로 한다. 몇몇 연구 결과는 이 접근이 중요한 약속19,32,33,34가있다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 암 세포 생물학 또는 미토콘드리아 표적화 처리에 있는 이 신진 대사 편차는 미토콘드리아 기능에 근거를 둔 전통적인 생존가능성 소사에 현저하게 영향을 미칠 수 있습니다.
여기서, 차동 핵 염색 분석에 대한 최적화된 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 미토칸의 세포 독성 또는 다른 화합물과의 조합의 빠르고 정확한 측정을 허용합니다. Hoechst 33342는 세포막을 쉽게 교차시켜 DNA를 얼룩지게 하는 세포 침투 핵 염료로, 총 세포 수를 얻을 수 있게 한다. 죽은 세포의 핵만으로 들어가는 PI와 공동 염색함으로써, 살아있는 비율(Hoechst 만) 및 죽은(둘 다염색) 세포가 정확하게 결정될 수 있다. 이 프로토콜은 공표된분석법(35)을 단계별 염료 농도 최적화를 위한 단계(직교 트라이팬 블루 방법을 이용한 교차 참조 결과)와 이미징 전에 플레이트의 원심분리를 정제한다. 많은 세포주반 부착 또는 일시 중단되기 때문에 원심분리는 이미지화되어 정확도를 강하게 향상시키는 세포의 비율을 증가시킵니다. 분석법은 스테인링이 미디어 또는 세척을 제거할 필요가 없다는 것을 포함하여 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 혼합물은 또한 저렴하고, 준비하기 쉬우며, 멀티채널/로봇 파이펫팅 시스템과 호환됩니다.
세포가 염색된 후에, 그(것)들은 자동화한 현미경으로 심상입니다. 이는 나중에 다시 분석할 수 있는 이미지의 영구 기록을 만드는 장점이 있으며, 특정 화합물의 효과는 캡처된 이미지의 육안 검사에 의해 재평가될 수 있다. 이미지를 획득하면 셀을 수동으로 또는 무료(예: ImageJ, CellProfiler 등) 및 상용 소프트웨어(예: 변형, Gen5 등)를 포함한 여러 소프트웨어 패키지를 사용하여 셀을 계산할 수 있습니다. 자동화된 셀 카운팅은 일반적으로 수동 셀 계산보다 더 정확하고 편향이 적기 때문에 일반적으로 바람직합니다. 또한 세포 파편이나 용해성 복합체를 보다 효과적으로 무시합니다. 이러한 파이프라인의 개발은 일반적으로 간단하며 사용되는 얼룩의 효율성에 의해 단순화됩니다. 출력은 실제 죽은 세포의 수가 총 세포 수에 대하여 자동으로 계산되기 때문에 정량적이며, 다른 임계값은검출(35)의스트링성을 증가 또는 감소시키기 위하여 적용될 수 있다. 편의를 위해 Gen5 대 3.00 소프트웨어 호환 Cytation 5 셀 이미징 멀티 모드 리더를 사용하여 셀 을 계산하기 위한 최적화된 매개 변수가 포함되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoechst/PI 세포 독성 분석에 대한 프로토콜은 견고하고 비교적 작은 실습 시간이 필요하지만 정확한 결과를 보장하는 데 매우 중요한 몇 가지 실험 적 세부 사항이 있습니다. 첫째, DMSO의 농도가 0.5%(v/v) 이하로 유지되도록 하는 것이 필수적입니다. 일반적으로 DMSO의 저용량에도 노출되면 세포의 형태와 부착을 실질적으로 변화시키고 세포 주기 진행을 크게 지연시킬 수 있다는 데동의된다<su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, 암 연구에 있는 CPRIT 학자, 그들의 관대 한 지원에 대 한 텍사스의 암 예방 및 연구 연구소 (CPRIT) 감사, CPRIT 부여 RR150044. 이 작품은 또한 웰치 재단 연구 보조금 C-1930에 의해 지원되었다, 건강 R35 GM129294 NVK에 수여 국립 연구소에 의해. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
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