Quantitation du virus de la rage dans diverses structures cérébrales bovines

Summary

Ce protocole présente une approche basée sur qRT-PCR pour déterminer le numéro de copie de gène de nucléoprotéine de virus de rage (N) dans diverses structures anatomiques de cerveau bovin utilisant la transcription in vitro.

Abstract

La rage paralytique bovine (BPR) est une forme d’encéphalite virale d’une importance économique importante dans toute l’Amérique latine, où elle présente un risque zoonotique majeur. Ici, notre objectif était d’utiliser un protocole de laboratoire pour déterminer le nombre relatif de copies du génome du virus de la rage (RABV) dans différentes structures anatomiques du cerveau bovin à l’aide de la réaction quantitative en temps réel de la chaîne de polymérase de transcription inverse (qRT-PCR). qRT-PCR quantifie le nombre spécifique de copies génétiques présentes dans un échantillon à partir de la fluorescence émise après amplification qui est directement proportionnelle à la quantité d’acide nucléique cible présent dans l’échantillon. Cette méthode est avantageuse en raison de sa courte durée, de son risque réduit de contamination et du potentiel de détection plus facile des acides nucléiques viraux dans différents échantillons par rapport à d’autres techniques. Le cerveau de six animaux enragés a été divisé en six structures anatomiques, à savoir la corne d’Ammon, le cervelet, le cortex, la médulle, les pons et le thalamus. Tous les cerveaux ont été identifiés comme positifs pour des antigènes rabv basés sur un essai direct d’immunofluorescence. Les mêmes structures anatomiques du cerveau de quatre bovins négatifs au RABV ont également été évaluées. L’ARN a été extrait de chaque structure et utilisé pour qRT-PCR. Un essai a été effectué pour déterminer les numéros de copie des gènes RABV à l’aide d’un gène nucléoprotéine transcrit in vitro. La courbe standard utilisée pour quantifier l’ARN viral présentait une efficacité de 100 % et une linéarité de 0,99%. L’analyse a indiqué que le cortex, la médulle, et le thalamus étaient les portions idéales de CNS pour l’usage dans la détection de RABV, basé sur l’observation que ces structures ont possédé les niveaux les plus élevés de RABV. La spécificité du test était à 100%. Tous les échantillons étaient positifs, aucun faux positif n’a été détecté. Cette méthode peut être utilisée pour détecter rabv dans les échantillons qui contiennent de faibles niveaux de RABV lors du diagnostic de BPR.

Introduction

La rage peut être confirmée ante mortem et post mortem par diverses techniques qui permettent la détection d’acides nucléiques viraux dans le cerveau, la peau, l’urine ou la salive¹. La détection du gène de nucléoprotéine de virus de rage(N)est principalement employée pour le diagnostic de rage par des essais moléculaires. Ce gène est également utilisé pour le génotypage viral. La rage peut être diagnostiquée chez les animaux en utilisant n’importe quelle partie du cerveau affecté; toutefois, pour exclure la possibilité de la rage, les tissus d’au moins deux régions du cerveau doivent être testés². Plusieurs méthodes diagnostiques existent pour la détection de la rage chez les animaux; cependant, le test d’immunofluorescence directe reste la technique de référence standard³. D’autres essais incluent des essais biologiques qui incorporent l’inoculation de souris, l’infection dans la culture de tissu, et la réaction en chaîne de polymése (PCR)^4. Toutes ces techniques sont recommandées par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE) pour le diagnostic de la rage chez l’homme et l’animal,^{respectivement 5}.

Les techniques de détection et d’amplification de l’acide nucléique ont révolutionné le diagnostic de la^{rage au cours des dernières années 6} et ces techniques jouent un rôle important dans le diagnostic ante mortem de la rage humaine. Plusieurs tests basés sur pcr ont été évalués pour compléter les tests conventionnels pour les diagnostics anti mortem et post mortem ^{de rage 7,8,9,10}. La plupart des analyses ciblent le gène viral de nucléoprotéine de rage pour l’amplification qui est la région la plus fortement conservée dans le génome viral^1,11. Au cours des 20 dernières années, divers tests moléculaires ont été développés pour diagnostiquer rabv, et certains de ces tests ont été utilisés pour la caractérisation du virus. La plupart des essais ont pour but de détecter les gènes conservés dans le génome viral, le plus souvent en utilisant des analyses conventionnelles ou quantitatives en temps réel de la chaîne de polymése (qRT-PCR)^12,13.

Pcr est une technique de diagnostic très sensible qui peut détecter le génome d’un agent pathogène donné dans les tissus, même lorsque ces tissus sont décomposés. À l’aide d’approches basées sur la PCR, des quantités minimales d’un agent infectieux peuvent être détectées dans un échantillon clinique par l’amplification sélective et répétitive d’une séquence de nucléotides^{d’ADN 14}. qRT-PCR qui incorpore des sondes fluorescentes (p. ex., TaqMan) ou des colorants liant l’ADN (p. ex., SYBR Green) a été utilisé dans des essais pour diagnostiquer rabv ante– et post– mortem avec une sensibilité élevée; toutefois, une telle approche nécessite un équipement spécialisé. Pour surmonter cette limitation, l’amplification isothermale à médie en boucle de transcription inverse (RT-LAMP) a été suggérée, basée sur son faible coût, sa simplicité et ses caractéristiques souhaitables pour la détection du RABV. Cet essai est particulièrement important car il peut être utilisé dans les pays en développement¹⁵.

qRT-PCR est basé sur la détection et la quantification d’une molécule, où les augmentations de signal fluorescent sont en proportion directe de la quantité de produit PCR en une seule réaction. À mesure que le nombre de copies de la cible de l’acide nucléique augmente, la fluorescence augmente également. Les colorants intercalaires non spécifiques tels que le colorant liant l’ADN SYBR Green ou les sondes oligonucléotides spécifiques à la séquence transportant un fluorophore et un quencher sont couramment utilisés pour fournir la lecture fluorescente dans qRT-PCR. Cet essai offre des avantages par rapport au RT-PCR conventionnel qui incluent un temps d’essai plus court (2-4 h), un risque réduit de contamination dû au système de tube fermé (absence de manipulation post-PCR des produits amplifiés), et la capacité de détecter différentes cibles simultanément¹⁶. qRT-PCR peut être utilisé pour diagnostiquer l’anti mortem de la rage à partir de salive et d’autres échantillons. Cet essai peut également être utilisé comme un test universel en temps réel pour la détection de différentes espèces de Lyssavirus ou lignées de RABV¹⁵. Dans cette approche RT-PCR combo, deux réactions sont utilisées. Le premier détecte différents linages génétiques du RABV, et le second détecte les espèces de Lyssavirus. Les deux étapes impliquent des analyses qRT-PCR, où la première utilise des sondes d’hybridation et la seconde utilise des dyes¹⁵. En raison du grand nombre de tests qui ont démontré la détection moléculaire réussie du RABV à l’aide de cette technique, l’actuel Manuel terrestre de l’OIE (2018) recommande l’utilisation du PCR pour la détection moléculaire du RABV¹⁷.

Le Mexique est un pays avec un potentiel d’élevage considérable. Les États où la production animale est la plus élevée contiennent à la fois des régions tropicales humides et des régions sèches à risque d’épidémies de rage en raison de la présence de la chauve-souris vampire Desmodus rotundus, principal émetteur de la rage. Il est donc essentiel de développer davantage d’outils de prévention et de lutte contre la rage paralytique bovine (BPR) au Mexique. Sur cette base, l’objectif de cette étude était d’utiliser qRT-PCR quantitative pour déterminer le nombre de particules virales dans différentes structures anatomiques du cerveau bovin après la mort due à l’infection par la rage.

Six cerveaux obtenus à partir de bovins positifs au RABV ont été donnés par un laboratoire externe pour l’utilisation dans le développement du protocole qRT-PCR décrit ci-dessous. Les échantillons de structure cérébrale bovine ont été transportés à la chaîne froide au laboratoire BSL-2 du laboratoire DE LNE-MA de l’INIFAP et stockés à -80 °C jusqu’à utilisation. Des cerveaux ont été obtenus des animaux des États de Campeche, Yucatán, et Querétaro. Avant la réception, diverses structures ont été disséquées du cerveau. Ces structures comprenaient la corne de l’Ammon, le cervelet, le cortex, la médulle, les pons et le thalamus^18,19. Le matériel génétique a été extrait tel que décrit ci-dessous. Le diagnostic rabv a été confirmé utilisant les anticorps fluorescents directs (DFA)^20. Comme un contrôle positif, cerveaux de souris qui ont été inoculés avec RABV^{21 ont} été utilisés. En outre, quatre cerveaux de bovins négatifs au RABV (déterminés par le DFA) ont été utilisés comme témoins négatifs.

Protocol

Cette étude a été approuvée et menée dans le strict respect des recommandations relatives à l’utilisation des animaux fournies par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA). 1. Échantillons Utilisez différentes zones du cerveau disséquées à partir de 6 cerveaux bovins positifs à la rage pour l’analyse RT-PCR. 2. Anticor…

Representative Results

Les résultats de DFA ont montré 100%, 100%, 83.3%, 66%, et 50% positivité pour RABV dans le cortex, thalamus, medulla, pons, et corne, respectivement. Ces résultats ont confirmé les résultats précédents, et au moins trois des structures disséquées de chaque cerveau étaient positives pour RABV. Une coloration positive représentative du DAF est indiquée dans la figure 1. La figure 2 montre l’amplification d’un fragment …

Discussion

Des études antérieures ont montré que le DFA ne peut détecter rabv que dans les sept jours suivant le stock de l’échantillon à température ambiante (21 °C)¹⁴. En revanche, ces travaux ont démontré que la sensibilité de RT-PCR commence à diminuer après que les échantillons ont été exposés à la température ambiante pendant 12 jours. Par conséquent, le génome rabv peut être détecté par qRT-PCR dans les échantillons exposés à la température ambiante pendant un jusqu’à …

Materials

Chloroform	SIGMA	C7559	Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol	Amresco	193-500	Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed	Biotium	41003	A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary DNA strand.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7	Promega	P1300	In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.