Summary
यह प्रोटोकॉल एक ट्रांस-फेमोरल एक्सेस का उपयोग करके एकएपोई-/-पृष्ठभूमि के साथ चूहों के पेट महाधमनी में मानव कोरोनरी स्टेंट के प्रत्यारोपण का वर्णन करता है । अन्य पशु मॉडलों की तुलना में, मुरीन मॉडल उच्च थ्रूपुट, प्रजनन क्षमता, हैंडलिंग और आवास में आसानी और आणविक मार्कर की व्यापक उपलब्धता के फायदे लेते हैं।
Abstract
एक कोरोनरी स्टेंट की तैनाती के साथ संयुक्त Percutaneous कोरोनरी हस्तक्षेप (पीसीआई), कोरोनरी धमनी रोग के हस्तक्षेप उपचार में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करता है । इन-स्टेंट रेस्टेनोसिस (आईएसआर) स्टेंट के भीतर नियोटिमल ऊतक के अत्यधिक प्रसार से निर्धारित होता है और स्टेंट की दीर्घकालिक सफलता को सीमित करता है। पोर्सिन कोरोनरी और खरगोश इलियाक धमनी मॉडल के साथ इन-स्टेंट रेटेनोसिस (आईएसआर) अंतर्निहित रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए विभिन्न प्रकार के पशु मॉडलों का उपयोग किया गया है। मुरीन मॉडल उच्च थ्रूपुट, हैंडलिंग और आवास में आसानी, प्रजनन क्षमता और आणविक मार्कर की व्यापक उपलब्धता के फायदे प्रदान करते हैं। एपोलीपॉप्रोटीन ई की कमी(apoE-/-) माउस मॉडल व्यापक रूप से हृदय रोगों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, स्टेंट को चूहों में प्रत्यारोपित करने के लिए छोटा किया जाना चाहिए, जिसमें उनके यांत्रिक और (संभावित) जैविक गुणों के महत्वपूर्ण परिवर्तन शामिल हैं। apoE काउपयोग-/-चूहों apoE के रूप में इन कमियों को दूर कर सकतेहै-/चूहों मानव आकार कोरोनरी स्टेंट के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, जबकि एक ही समय में एक एथेरोजेनिक फेनोटाइप प्रदान करते हैं । इससे उन्हें स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद आईएसआर की जांच करने का एक बेहतरीन और भरोसेमंद मॉडल बना दिया जाता है। यहां, हम विस्तार से वर्णन करते हैं, एक ट्रांस-फेमोरल एक्सेस का उपयोग करके एकएपोई-/-पृष्ठभूमि के साथ चूहों के पेट महाधमनी में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव कोरोनरी स्टेंट का प्रत्यारोपण ।
Introduction
एक कोरोनरी स्टेंट की तैनाती के साथ संयुक्त परक्यूटेनियस कोरोनरी हस्तक्षेप (पीसीआई), कोरोनरीधमनीरोग 1 के हस्तक्षेप उपचार में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करता है। स्टेंट की दीर्घकालिक सफलता, हालांकि, इन-स्टेंट रेस्टेनोसिस (आईएसआर) की घटना से सीमित हो सकती है जो स्टेंट2,3के भीतर नियोटिटिमल ऊतक के अत्यधिक प्रसार से निर्धारित होती है। आईएसआर को कोरोनरी धमनी बाईपास या पुनः पीसीआई के साथ फिर से हस्तक्षेप की आवश्यकता हो सकती है। आईएसआर के अध्ययन के लिए विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल सुझाए गए हैं, जिनमें से प्रत्येक में लाभ और कमियों की विशेषता है । सबसे अधिक इस्तेमाल किया पोर्सिन कोरोनरी और खरगोश iliac धमनी मॉडल की प्रमुख कमियां, हालांकि स्पष्ट रूप से स्टेंट प्रत्यारोपण4,5के बाद मनुष्यों के समान घावों का विकास, बड़े पशु और आवास की लागत है जो विशेष रूप से दीर्घकालिक अध्ययन में सैंय कठिनाइयों को लाता है, साथ ही हैंडलिंग और उपकरणों में सीमाएं । इसके अलावा, सूअर और खरगोशों के सेलुलर प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी की उपलब्धता सीमित है। दूसरी ओर, मुरीन मॉडल उच्च थ्रूपुट और प्रजनन क्षमता के प्रमुख फायदे प्रदान करते हैं, साथ ही हैंडलिंग, आवास और इसलिए लागत प्रभावशीलता में आसानी प्रदान करते हैं। इसके अलावा, एंटीबॉडी की एक उच्च संख्या उपलब्ध हैं। हालांकि, जबकि एपोलीपोप्रोटीन ई-कमी (apoE-/-) चूहों मोटे तौर पर atherosclerosis6,7,8के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, वे आईएसआर के अध्ययन के लिए अनुपयुक्त है के रूप में स्टेंट चूहों में प्रत्यारोपित किया जाना है, संभावित ' स्टेंट यांत्रिक गुणों को बदलने के लिए छोटा होना चाहिए । इसके अलावा, चूहों की महाधमनी दीवार युवा चूहों में 50 माइक्रोन और पुराने चूहों में 85 माइक्रोन के बीच उपाय करती है9,और स्टेंट को 2 एटीएम के रूप में कम दबाव के स्तर का उपयोग करके तैनात किया जाना चाहिए, जिससे स्टेंट10की मैलापोजिशन हो सकती है। चूहों, हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव कोरोनरी स्टेंट के प्रत्यारोपण के लिए अनुमति देते हैं, और महाधमनी स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद बड़े जानवरों के समान एक संवहनी चिकित्सा पाठ्यक्रम प्रदर्शित करते हैं, जो पहले लैंगवेल्ड एट अल11द्वारा सूचित किया गया था। इस तकनीक को मूल रूप से ट्रांस-पेट पहुंच की आवश्यकता होती है, जिसके लिए रक्त प्रवाह के अस्थायी व्यवधान को प्राप्त करने के लिए महाधमनी के शारीरिक संकुचन की आवश्यकता होती है। संभावित रूप से जुड़े पोत की चोट और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए, तकनीक को बाद में ट्रांस-इलियाक एक्सेस की शुरुआत से परिष्कृत किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप जानवरों की उच्च जीवित रहने की दर12हुई।
क्योंकि वाइल्डटाइप चूहों को एथेरोस्क्लेरोटिक घाव विकसित नहीं होते हैं13,एपो-/-चूहों को ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-लाइक इफेक्टर न्यूक्लियेज (टैलेन)14जैसी नाभिक तकनीकों का उपयोग करके उत्पन्न किया गया है, क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR/Cas9)15,और जिंक फिंगर (जेडएफ)16। 2011 सेचूहे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। एथेरोजेनिक पृष्ठभूमि प्रदान करना,apoE-/-चूहों मानव आकार कोरोनरी स्टेंट के एक और अधिक यथार्थवादी मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, विशेष रूप से आईएसआर के संबंध के साथ ।
इसके साथ ही, हम ट्रांसफेमोरल एक्सेस रूट के माध्यम से विधि का वर्णन करते हैं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पतली-अकड़ कोबाल्ट-क्रोमियम दवा-एल्यूटिंग स्टेंट (डीईएस) का उपयोग करते हैं, हालांकि, इसे अन्य स्टेंट (बीएमएस) या बायोडिग्रेडेबल स्टेंट जैसे अन्य स्टेंट के अध्ययन के लिए भी लागू किया जा सकता है।
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Protocol
यह प्रयोग जर्मन पशु कल्याण कानून (TSchG) और निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ के अनुसार किया गया था जो वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए उपयोग किए जाने वाले पशुओं की सुरक्षा से संबंधित था । इस अध्ययन के लिए आधिकारिक मंजूरी सरकारी पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल संख्या: AZ 87-51.04.2010.A065) द्वारा दी गई थी; लैंडेसमट फ्यूर नतूर, उमवेल्ट एंड वर्ब्राउचरचुट्ज नोर्फ्रेइन-वेस्टफालेन, रेकलिंगहौसेन, जर्मनी)। अध्ययन प्रोटोकॉल देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के साथ पालन किया । पश्चात दर्द उपचार प्रयोगशाला पशु विज्ञान के लिए जर्मन सोसायटी (जीवी-SOLAS) के साथ ही पहल पशु चिकित्सा दर्द चिकित्सा की सिफारिशों पर आधारित है ।
1. बुनियादी तकनीकों और सामान्य प्रक्रियाओं
- होमोज़िगस एपोए -/-स्प्राग-डावले चूहों का उपयोग करें। मानक तरीकों का उपयोग करके प्रत्येक पशु के जीनोटाइप की पहचानकरें 17.
- जानवरों को समान परिस्थितियों में रखें (21 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस, 60% ± 5% आर्द्रता, और 12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र) और पानी और भोजन तक मुफ्त पहुंच सुनिश्चित करें।
- स्वच्छ लेकिन गैर बाँझ परिस्थितियों में सभी प्रक्रियाओं को पूरा करें।
- एक बार चूहा एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, 16x के आवर्धन पर सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत सभी प्रक्रियाएं करें।
- संपीड़न हेमोस्टेसिस के लिए कपास झाड़ू का प्रयोग करें। गट्टे वाले रिंगर समाधान से लथपथ गॉज झाड़ू (5 सेमी x 5 सेमी) कमर नम रखने में मददगार होते हैं।
- उपयोग की गई सामग्रियों को निपटाने के लिए अपशिष्ट निपटान विनियमों का पालन करें।
2. सर्जरी से पहले तैयारी
- ऑपरेशन शुरू करने से पहले वेटनरी दवाएं तैयार करें। कमरे के तापमान पर सभी समाधान रखें, जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।
- प्रक्रिया से तीस मिनट पहले, 0.03-0.05 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन को चमड़े के साथ प्रशासित करें ।
- 100 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन (बीडब्ल्यू) (एस) केटामाइन और 8 मिलीग्राम/किलो बीडब्ल्यू जाइलाज़ीन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें ।
- वजन के पैमाने का उपयोग करके चूहे के वजन का आकलन करें।
- चूहे को हीटिंग पैड पर रखें और मेडिकल टेप का उपयोग करके ऊपरी और निचले अंगों को ठीक करें। अपने बाएं हिंद अंग के साथ चूहे को पूरी तरह से विस्तारित और जितना संभव हो सके अपनी रीढ़ के अनुरूप रखें ताकि ऊर्ध्वाधर धमनी और महाधमनी के बीच एक सीधी रेखा बनाई जा सके। इससे महाधमनी विभाजन के माध्यम से गुब्बारे पर चढ़कर स्टेंट को आगे बढ़ाने में आसानी होगी।
- 2 एल/मिन की प्रवाह दर पर 97.5% ऑक्सीजन में 1.5% आइसोफ्लुने की साँस लेने के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
नोट: चूहे को अनायास सांस लेने की अनुमति दें, बिना इंडबेशन के। - बेहोशी के दौरान आंखों को नुकसान से रोकने के लिए आंखों का मरहम लगाएं।
- चूहे के कमर और निचले पेट क्षेत्र से फर दाढ़ी और एक povidone-आयोडीन समाधान के साथ इसी त्वचा बंध्याकरण।
- सर्जरी शुरू करने से पहले, पूंछ टिप और इंटरडिजिटल ऊतक को चुटकी बजाकर संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई को सत्यापित करें।
3. सर्जरी
- त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी को खोलने के लिए बाईं कमर में ~ 0.5\u20121 सेमी का एक मध्याह्न चीरा बनाएं।
- स्पष्ट रूप से विच्छेदन और गहराई में जांच जब तक स्पंदन बाईं नारीधमनी की पहचान की जा सकती है ।
- बहुत बढ़िया संदंश का उपयोग करके, आसपास के संयोजी ऊतक को धीरे-धीरे हटाकर फीमोरल धमनी तैयार करें। न तो फीमोरल नर्व और न ही फेमोरल नस को नुकसान पहुंचाने के लिए सावधान रहें, जो धमनी में मध्याढि़त है।
- फेमोरल धमनी के बारे में 1 सेमी तैयार करें। धीरे-धीरे इसे उठाने के लिए पोत के नीचे संदंश की नोक को सावधानी से रखें।
- धमनी और फार्म स्लिंग्स के डिस्टल और समीपस्थ भागों के तहत 4-0 रेशम सीवन के धागे टुकड़े। सर्जिकल क्लैंप की शाखाओं के बीच दो धागे स्लिंग्स में से प्रत्येक के सिरों को दबाएं। धमनी को नियंत्रित करने के लिए सर्जिकल क्लैंप का उपयोग करें। रक्त प्रवाह को अस्थायी रूप से बाधित करने के लिए धीरे-धीरे स्लिंग्स को फैलाएं और उठाएं।
नोट: लंबे समय तक टूनीकेट से बचने के लिए तेजी से काम करें जिससे ऊतक क्षति हो सकती है। - तेज माइक्रो कैंची का उपयोग करना, फेमोरल धमनी के बीच में एक धमनी प्रदर्शन करते हैं।
- धमनी के माध्यम से एक गाइड तार परिचय। समीपस्थ धागे गोफन तक पहुंचने पर, सर्जिकल क्लैंप को स्थानांतरित करके धागे के तनाव को छोड़ दें और गाइड तार को पेट महाधमनी की ओर आगे बढ़ाएं।
नोट: हैंडलिंग की सुविधा के लिए एक तार कटर का उपयोग कर गाइड तार काटें। - डायाफ्राम और गुर्दे की धमनियों के बीच गाइड तार के समीपस्थ अंत रखें।
नोट: गाइड तार को आगे बढ़ाने बहुत दूर महाधमनी या हृदय की चोट का खतरा भालू । हम गाइड तार और स्टेंट की पर्याप्त स्थिति सुनिश्चित करने के लिए पेट खोलने की सलाह देते हैं। - गाइड तार पर 2.25 मिमी x 8 मिमी (अधिकतम 2.5 मिमी x 8 मिमी) को मापने वाला एक समेटा हुआ और गुब्बारा-घुड़सवार कोरोनरी स्टेंट पेश करें और इसे पेट महाधमनी में आगे बढ़ाएं।
- स्टेंट को महाधमनी विभाजन के ठीक ऊपर बल्कि गुर्दे की धमनियों के नीचे रखें। एक मुद्रास्फीति सिरिंज प्रणाली का उपयोग करके 15 एस के लिए 12 एटीएम के लिए गुब्बारा कैथेटर फुलाने द्वारा स्टेंट तैनात करें ।
- गुब्बारे कैथेटर को डिफ्लेट करें और उपयोग में स्टेंट के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार नकारात्मक दबाव बनाए रखें।
- स्टेंट को जगह में छोड़ते समय धीरे-धीरे हवा निकाल कैथेटर निकाल लें।
- कैथेटर को बाहर निकालने से ठीक पहले, रक्त प्रवाह को फिर से बाधित करने के लिए सर्जिकल क्लैंप के साथ चीरा के ऊपर थ्रेड लूप पर तनाव पैदा करें। फिर गुब्बारे कैथेटर को हटा दें और सीधे पोत को समीपस्थ रूप से लिगेट करें।
- समीपस्थ और डिस्टल थ्रेड लूप को फेमोरल धमनी को लिगेट करने और आर्टेरियोटॉमी के पर्याप्त hemostasis की पुष्टि करने के लिए बांधें। जमानत धमनियों अंग के लिए आगे परफ्यूजन सुनिश्चित करेगा।
- धमनी को ओवरलिंग करने वाली मांसपेशियों को बंद करें, साथ ही 10-0 गैर-पुनर्बेबल टांके का उपयोग करके त्वचा चीरा।
4. स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद पशु देखभाल
- ऑपरेशन के तुरंत बाद, चूहे को गर्म हवा (30\u201235 डिग्री सेल्सियस) और ऑक्सीजन की आपूर्ति के साथ एक विशेष गहन देखभाल इकाई पिंजरे में 60 मिनट तक ठीक होने दें।
- पूरी तरह से बरामद होने तक जानवरों को ध्यान से देखें। बाद में, चूहों को एक सामान्य पिंजरे में ले जाएं। विज्ञापन लिबिटम पानी और भोजन तक पहुंच प्रदान करें।
- नैदानिक मूल्यांकन के तहत कुल 72 घंटे के लिए 0.03-0.05 मिलीग्राम/किलोग्राम बुप्रेनोरफिन (एस.c, 500μl NaCl में) के साथ हर 6-12 घंटे में पश्चात एनाल्जेसिया का प्रशासन करें।
- प्रत्यारोपित स्टेंट के थ्रोम्बोसिस से बचने के लिए क्लोपिडोग्रेल (15 मिलीग्राम/किलो) के साथ भोजन मिलाया हो।
- हाइपरकोलेस्टेरोलेमिक स्थितियों और पट्टिका गठन को बढ़ाने के लिए, जन्म के बाद 6 \u20128 सप्ताह में पश्चिमी आहार खिलाना शुरू करें और इच्छामृत्यु तक जारी रखें। यदि वांछित है, तो जानवरों की एक पलटन सामान्य चूहा चाउ खिलाया नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है।
5. ऊतक संग्रह और प्रसंस्करण
- निर्धारित समय बिंदु पर ऊतक उन्मूलन शुरू करने से पहले, IACUC दिशानिर्देशों के अनुसार जानवर को इच्छामृत्यु दें। अवलोकन अवधि के अंत में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए स्टेंट्ड महाधमनी को काटा जाए।
- एक मिडलाइन चीरा द्वारा पेट खोलें और महाधमनी के स्टेंट्ड सेगमेंट के साथ-साथ महाधमनी के आसन्न गैर-स्टेंट वाले हिस्सों को हटा दें, जो प्रत्येक 0.5 सेमी को मापते हैं।
- निर्धारण के लिए 24 घंटे के लिए 4% बफर फॉर्मेलिन के समाधान में ऊतक रखें।
- प्लास्टिक में स्टेंट किए गए धमनी ऊतक को एम्बेड करें और मानक प्रोटोकॉल18,19के अनुसार हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला करते हैं ।
6. हिस्टोमॉर्मोमेट्रिक विश्लेषण
- एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर से जुड़े माइक्रोस्कोप के माध्यम से स्टेंट्ड महाधमनी के समीपस्थ, मध्य और डिस्टल भाग के अनुक्रमिक वर्गों का हिस्टोमॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण करें।
- बाहरी लोचदार लैमिना (ईईएल, एडवेंटिया और मीडिया के बीच), आंतरिक लोचदार लैमिना (आईईएल, मीडिया और नियोंटिमा के बीच), और ग्राफिक ड्राइंग टैबलेट के साथ ल्यूमेन की रूपरेखा का पता लगाएं। इन मूल्यों से, सॉफ्टवेयर के साथ ईल क्षेत्र, आईईएल क्षेत्र और लुमेन क्षेत्र की गणना करें।
- प्रतिशत क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र इन-स्टेंट रेस्टेनोसिस (आईएसआर) की गणना करें:
- कुल नियोनिटमल क्षेत्र (एआई)की गणना करें:
- अकड़ और ल्यूमेन के बीच की दूरी के रूप में प्रत्येक स्टेंट अकड़ पर नियोटिटिमल मोटाई (एनआईटी) को मापें। आईईएल और ल्यूमेन के बीच की दूरी के रूप में स्टेंट अकड़ के बीच एनआईटी को मापें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, एनआईटी की गणना के रूप में
जहां पीएल और पीआईईएल क्रमशः20ल्यूमेन और आंतरिक लोचदार लैमिना परिधि हैं। - अध्ययन की आवश्यकताओं के अनुसार अतिरिक्त विश्लेषण करें।
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Representative Results
यह प्रोटोकॉल ट्रांस-फेमोरल एक्सेस मार्ग(चित्रा 1)का उपयोग करके चूहों के पेट महाधमनी में स्टेंट प्रत्यारोपण का वर्णन करता है। इस पशु मॉडल का पहला केंद्रीय बिंदु यह है कि यह मानव आकार के कोरोनरी स्टेंट की तैनाती के लिए अनुमति देता है। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रिम्प्ड और गुब्बारे पर चढ़कर कोरोनरी स्टेंट चूहों के पेट महाधमनी में रखा जा सकता है। इस प्रकार, इसके अलावा, मनुष्यों में स्टेंट तैनाती का एक ही सिद्धांत लागू किया जा सकता है। चूहों के उपयोग का एक अन्य लाभ आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों की उपलब्धता है, जैसे किएपोई-/-चूहे, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।
हमने हाल ही में इस विधि को यह मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया है कि क्या एपोलीपोप्रोटीन ई-कमी चूहों को वाइल्डटाइप चूहों21की तुलना में आईएसआर विकसित करने का अधिक खतरा है । स्टेंट प्रत्यारोपण के दौर से गुजर रहे कुल 42 पुरुष चूहों से, 36 चूहों ने 28 दिनों के बाद अध्ययन प्रोटोकॉल पूरा किया (जीवित रहने की दर = 85.71%)। दो चूहों प्रत्येक पोत बंद विफलता, आंतरिक रक्तस्राव, और स्टेंट थ्रोम्बोसिस से मर गया । तीन जानवरों से स्टेंट का विश्लेषण नहीं किया जा सका क्योंकि प्रसंस्करण विफलताओं के कारण ऊतक गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त या बाधित हो गया था। सबसे अधिक संभावना है, यह पालन प्रक्रिया के दौरान हुआ। हम अध्ययन शुरू होने से पहले कई बार इस तकनीक को करने के लिए प्रशिक्षण की सलाह देते हैं।
शेष 33 चूहों में, मानव आकार के कोरोनरी स्टेंट को सफलतापूर्वक तैनात किया गया था जिसमें मैलापोजिशन या पोत चोट(टेबल 1)का कोई संकेत नहीं था। शरीर का वजन वाइल्डटाइप एपो+/+ और एपोई-/-चूहों (५३०.१ ± १५.९४ ग्राम बनाम ५१३.६ ± १६.४५ ग्राम) में समान था । होमोज़िगस एपो-/-चूहों ने वाइल्डटाइप एपो+/+ चूहों(चित्रा 2)की तुलना में स्पष्ट रूप से ऊंचा नियोनिटमल हाइपरप्लासिया और आईएसआर विकसित किया । यद्यपि एकएपोई-/-पृष्ठभूमि जानवरों को एथेरोस्क्लेरोसिस के लिए अधिक संवेदनशील बना देती है, खासकर जब पश्चिमी आहार खिलाया जाता है, तो हमने अपने चूहों में किसी भी पूर्ववर्ती एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े का पालन नहीं किया, सबसे अधिक संभावना है क्योंकि एक पश्चिमी आहार सर्जरी तक शुरू नहीं किया गया था और चार सप्ताह की बाद की अवलोकन अवधि एथेरोस्क्लेरोटिक घाव विकास के लिए बहुत कम थी।
चित्रा 1: एक ट्रांस-फेमोरल एक्सेस का उपयोग करके चूहों के पेट महाधमनी में स्टेंट प्रत्यारोपण की स्कीमा।
(क)रक्त प्रवाह में रुकावट के बाद, एक गाइड तार को एक मध्य धमनी के माध्यम से पेश किया जाता है। (ख)गाइड वायर के ऊपर एक क्रिम्प्ड और बैलून माउंटेड कोरोनरी स्टेंट को फेमोरल धमनी में पेश किया जाता है । (ग)गुब्बारे पर चढ़कर स्टेंट पेट महाधमनी के लिए उन्नत है, जहां यह गुब्बारा मुद्रास्फीति द्वारा तैनात किया जाता है । स्टेंट को विभाजन के ऊपर और गुर्दे की धमनियों के नीचे रखा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: पश्चिमी आहार-फेड में स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद 28 दिनों में गिमसा-दाग पेट महाधमनी के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ।
(क)वाइल्डटाइप एपो+/+ चूहे और(ख)होमोजिजियस एपो-/-चूहे । उच्च शक्ति छवियां: एनआई = neointima, सेंट = स्टेंट अकड़, एम = ट्यूनिका मीडिया, एल = lumen । चित्रा कॉर्नेलिसेन, ए एट अल21से संशोधनों के साथ पुन: पेश किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| चूहों की संख्या | |
| पोत बंद होने की विफलता | 2 |
| आंतरिक नकसीर | 2 |
| स्टेंट थ्रोम्बोसिस | 2 |
| ऊतक प्रसंस्करण विफलता | 3 |
| प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक पूरा होना | 33 |
तालिका 1: ट्रांस-फेमोरल एक्सेस का उपयोग करके चूहे के पेट महाधमनी में स्टेंट प्रत्यारोपण का परिणाम।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल एपोई के पेट महाधमनी में मानव आकार के कोरोनरी स्टेंट के प्रत्यारोपण का वर्णन करताहै-/-चूहों । कई तकनीकी बिंदु जोर देने लायक हैं। सबसे पहले, स्टेंट के आकार और महाधमनी के आकार के बीच एक बेमेल से बचना चाहिए। बहुत छोटा स्टेंट रखने से स्टेंट की मात्रा बढ़ सकती है, जबकि एक स्टेंट का प्रत्यारोपण जो महाधमनी के लिए बहुत बड़ा है, से अधिक स्ट्रेच, फाड़ और पोत की चोट हो सकती है। इसलिए, हम व्यास में 2.0 और 2.5 मिमी के बीच स्टेंट का उपयोग करने की सलाह देते हैं, और स्टेंट को अधिक फैलाए बिना अनुशंसित सीमा के भीतर प्रत्यारोपण दबाव बनाए रखने के लिए। सबसे उपयुक्त प्रत्यारोपण दबाव आमतौर पर स्टेंट निर्माता द्वारा दिया जाता है। फीमोरल नस की अतिरिक्त चोट और बाद में वेना कावा से बचा जाना चाहिए क्योंकि पोत की दीवारें बेहद पतली हैं और घायल करने में बहुत आसान हैं, जिसके परिणामस्वरूप रक्तस्राव होता है जिसे रोकना मुश्किल होता है। फीमोरल धमनी स्पंदन द्वारा फीमोरल नस से अलग है, जिसे ध्यान से देखा जाना चाहिए। एक और नुकसान धमनी चोट और विच्छेदन की संभावना है जब गाइडवायर और/ धमनी विच्छेदन को नियंत्रित करके और रेशम संबंधों का उपयोग करते हुए रेशम संबंधों का उपयोग करते हुए slings के साथ उदास धमनी को खींच कर कम किया जा सकता है। प्रतिरोध का सामना करने पर डिवाइस को तुरंत आगे बढ़ाना बंद करना जरूरी है। इस मामले में, अंगूठे और इंडेक्स फिंगर के बीच छोटे आंदोलन डिवाइस की दिशा बदलने में मदद करेंगे। हमारे अनुभव में, यह सबसे अधिक बार इंगिनल स्नायु के नीचे और आगे ऊपर का मामला होता है, जब आम इलियाक धमनी विभाजन के पास जाती है, क्योंकि यह यहां रेट्रोपेरिटोनियल अंतरिक्ष में गहराई से उतरता है। निश्चित रूप से जीवित रहने की दर स्थिर होने से पहले ऑपरेटर के लिए एक सीखने की अवस्था होगी और कुछ अनुभव के साथ, औसत शल्य चिकित्सा समय लगभग 20 मिनट है।
मनुष्यों में, स्टेंट आमतौर पर गंभीर रूप से संकुचित एथेरोस्क्लेरोटिक धमनियों में प्रत्यारोपित किए जाते हैं। यद्यपि सामान्य रूप से एपोई की कमी जानवरों को एथेरोस्क्लेरोटिक घावों के विकास के लिए अधिक संवेदनशील बना देती है, हमने अपने चूहों में किसी भी पट्टिका गठन का पालन नहीं किया, सबसे अधिक संभावना है क्योंकि पश्चिमी आहार भोजन स्टेंट प्रत्यारोपण तक शुरू नहीं किया गया था। यदि एथेरोस्क्लेरोटिक घावों में स्टेंट प्रत्यारोपण वांछित है, तो पश्चिमी आहार जन्म के बाद 6\u20128 सप्ताह में शुरू होना चाहिए और बलिदान तक जारी रहना चाहिए। अतिसंवेदनशील उपभेदों में एथेरोस्क्लेरोटिक घाव उच्च वसाआहार22 पर 7 \u201214 सप्ताह के बाद विकसित होंगे । अब तक,एपीओई-/-चूहों पर केवल सीमित आंकड़े प्रकाशित किए गए हैं । हालांकि, किसी भी अध्ययन ने 20 सप्ताह23की उम्र से पहले सहज घाव के विकास की सूचना नहीं दी। झाओ एट अल. ने 72 सप्ताह15में बलिदान तक पट्टिका बोझ और घाव की गंभीरता में निरंतर वृद्धि के साथ कम से कम 24 सप्ताह के बादएपोए में ठेठ एथेरोस्क्लेरोसिस मनाया । इस प्रकार, साहित्य के अनुसार, यह असंभव है कि चूहों की उम्र के 14-16 सप्ताह में सहज एथेरोस्क्लेरोसिस विकसित होगा। इसलिए, हम पुराने चूहों का उपयोग करने और जितनी जल्दी हो सके पश्चिमी आहार शुरू करने की सलाह देते हैं यदि पूर्व-गठित एथेरोस्क्लेरोटिक घावों में स्टेंट प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए वांछित है।
छह जानवरों की सर्जरी नहीं बच पाई । क्लोपिडोग्रेल के प्रशासन के बावजूद स्टेंट थ्रोम्बोसिस से दो जानवरों की मौत हो गई । स्टेंट थ्रोम्बोसिस को कम करने के लिए, जानवरों को एस्पिरिन के साथ 48 घंटे के लिए पूर्व-इलाज किया जा सकता है या एनोक्सपेरिन पोस्ट-ऑपरेटिव का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्राप्त किया जा सकता है। सर्जरी से एक दिन पहले क्लोपिडॉग्रेल शुरू करने से थ्रोम्बोसिस का खतरा भी कम हो सकता है, लेकिन एक ही समय में एंटी-थ्रोम्बोटिक थेरेपी की किसी भी गहनता से नकसीर का खतरा बढ़ जाता है । स्टेंट थ्रोम्बोसिस पीसीआई24, 25, 26की एक आम जटिलता है औरइसके कई कारण हो सकते हैं। संभवतः, हमारे अध्ययन में, स्टेंट थ्रोम्बोसिस मौत अपर्याप्त गुब्बारा मुद्रास्फीति और समवर्ती स्टेंट मैलापोजिशन से हुई। मनुष्यों में स्टेंट प्रत्यारोपण के विपरीत, चूहे के पेट महाधमनी में स्टेंट की तैनाती एंजियोग्राफी द्वारा नियंत्रित नहीं की गई थी। इसलिए, अप्रभावी गुब्बारे मुद्रास्फीति का पता नहीं लगाया जा सकता है और सर्जरी के दौरान सही किया जा सकता है। इसी तरह, स्टेंट की तैनाती से एक शाखा पोत का गैरइरादतन अनुमान लग सकता है । यह देखते हुए कि सर्जरी करना व्यावहारिक नहीं है जिसके लिए फ्लोरोस्कोपिक नियंत्रण के तहत सर्जिकल माइक्रोस्कोप के उपयोग की आवश्यकता होती है, हम कम से कम पहले कई प्रक्रियाओं के लिए स्टेंट की सटीक तैनाती की पुष्टि करने के लिए पेट खोलने की सलाह देते हैं। स्टेंट थ्रोम्बोसिस के अन्य संभावित कारण भड़काऊ प्रतिक्रियाएं, गंभीर चोट, या पोत की दीवार के विच्छेदन हो सकते हैं। सर्जन इन जटिलताओं का संकेत किसी भी नैदानिक संकेत के बारे में पता होना चाहिए, और जानवरों के अवलोकन अवधि के दौरान प्रत्येक दिन का निरीक्षण किया जाना चाहिए ।
चूहा पेट महाधमनी जानवर के वजन27, 28के आधार पर व्यास में 1.8 मिमी और3.0 मिमीके बीच मापता है। यहां तक कि छोटे फीमोरल और इलियाक धमनियों के माध्यम से एक भारी स्टेंट को आगे बढ़ाने से जलने की दीवार को इंटिमल आंसू और नुकसान हो सकता है। इसलिए, यह तकनीक महाधमनी की पोत दीवार के अधिक विस्तार या चोट से बचने के लिए छोटे स्टेंट (व्यास में 2.0 और 2.5 मिमी के बीच) के प्रत्यारोपण तक सीमित है।
एक और सीमा प्रक्रिया के बाद hemostasis प्राप्त करने के लिए फेमोरल धमनी को लिटिंग करने की आवश्यकता है, संभावित रूप से निचले अंग इस्केमिया का जोखिम होता है। हालांकि, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि संपाश्र्वक धमनियों के साथ-साथ ऑक्सक्लूजन के लिए माइक्रोवसकुलेचर डिस्टल के अनुकूलन चूहों29में फेमोरल धमनी के बंधन के बाद निचले अंग परफ्यूजन को बनाए रखने में सक्षम हैं, और हमारे किसी भी चूहे ने अवलोकन अवधि के दौरान निचले अंग इस्केमिया के नैदानिक संकेतों का प्रदर्शन नहीं किया। फिर भी, जांचकर्ताओं को इस संभावित जोखिम के बारे में पता होना चाहिए, क्योंकि अंग इस्केमिया न केवल पोस्ट-ऑपरेटिव मौत के संभावित कारण का प्रतिनिधित्व करता है, बल्कि संभावित रूप से एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया को भी प्रेरित कर सकता है, संभावित रूप से परिणामों को पूर्वाग्रह से रखना ।
जबकि सामान्य तौर पर चूहे एक लागत प्रभावी पशु मॉडल हैं, आनुवंशिक रूप से संशोधितएपोई-/-चूहों के उपयोग से लागत बढ़ जाती है । एक और सीमा यह है कि चूहों में एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े विकसित होने तक तुलनात्मक रूप से लंबा समय लगता है। इसके अलावा, महाधमनी और कोरोनरी धमनियों के बीच कुछ महत्वपूर्ण हेमोडायनामिक अंतर हैं जो करीब ध्यान देने के लायक हैं। कोरोनरी की तुलना में महाधमनी में कतरनी तनाव अधिक होता है, और अशांत रक्त प्रवाह के कारण विभाजन अनुपस्थित होते हैं। यह इंटिमल हाइपरप्लासिया के विकास और रेस्टेनोसिस की सीमा को कम करता है।
रेटेनोसिस कोरोनरी स्टेंट की दीर्घकालिक सफलता को सीमित करने वाले प्रमुख कारकों में से एक है। रेटेनोसिस के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के पशु मॉडलों का उपयोग किया गया है, प्रत्येक अपने स्वयं के फायदे और कमियों की विशेषता है। अन्य पशु मॉडलों की तुलना में, चूहों एक उच्च थ्रूपुट का लाभ पकड़ते हैं, हैंडलिंग और आवास, प्रजनन क्षमता के साथ-साथ लागत प्रभावशीलता में आसानी होती है, जबकि एक ही समय में मानव आकार के कोरोनरी स्टेंट के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है। चूहों में पेट के महाधमनी स्टेंटिंग का पहला प्रोटोकॉल लैंगवेल्ड एट अलअल 11द्वारा सूचित किया गया था। हालांकि, इस मॉडल को स्टेंट को पेश करने के लिए ट्रांस-पेट एक्सेस की आवश्यकता होती है, जो रक्त प्रवाह के अस्थायी व्यवधान को प्राप्त करने के लिए महाधमनी के शारीरिक संकुचन से जुड़ा हुआ है। जिसके परिणामस्वरूप हेरफेर और पोत चोट संभावित भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है, जो न केवल जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन यह भी स्पष्ट ISR12के लिए । बाद में, ओयामाडा एट अल ने आम इलियाकधमनी 12के माध्यम से स्टेंट पेश करके प्रोटोकॉल को संशोधित किया। उन्होंने दो अलग-अलग दृष्टिकोणों (ट्रांस-महाधमनी बनाम ट्रांस-इलियाक धमनी) के बीच जीवित रहने की दर की तुलना की और ट्रांस-पेट तैनात स्टेंट (57% बनाम 11%, पी < 0.05) के साथ जानवरों में काफी अधिक मृत्यु दर पाई। चूहों सबसे अधिक चीरा/सीवन साइट है, जो भयावह है जब पेट महाधमनी12में होने वाली पर थ्रोम्बोसिस से मर गया । इसके अलावा आघात को कम करने और मनुष्यों में प्रत्यारोपण तकनीक की नकल उतार और अधिक बारीकी से, हम एक ट्रांस-नारी का उपयोग करने के लिए स्टेंट परिचय और 14% की मृत्यु दर की सूचना का इस्तेमाल किया । दो चूहों प्रत्येक पोत बंद विफलता, आंतरिक रक्तस्राव, और स्टेंट थ्रोम्बोसिस से मर गया । हाल के अध्ययनों में, हालांकि, ट्रांस-महाधमनी एक्सेस30, 31के साथ भी चूहे के पेट महाधमनी में स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद मृत्यु दर 6% के रूप में कम बताई गई। फिर भी, संयुक्त रुग्णता और मृत्यु दर 13.4% थी, नेवज़ाती एट अल द्वारा एक अध्ययन में। चूहे महाधमनी30में मैग्नीशियम स्टेंट के प्रत्यारोपण के बाद। जबकि उनकी श्रृंखला में न तो पोत बंद करने की विफलता और न ही आंतरिक रक्तस्राव की सूचना दी गई थी, स्टेंट थ्रोम्बोसिस30चूहों के १०.५% में स्पष्ट था । दूसरी ओर, कुंभ एट अल ने फ्लो डायवर्टर्स के साथ साइडवॉल एन्यूरिज्म के इलाज के बाद किसी भी स्टेंट थ्रोम्बोसिस की रिपोर्ट नहीं की, हालांकि, इस अध्ययन में पतले स्टेंट अकड़ उपकरणों का इस्तेमाल किया गया, और दोहरी एंटीप्लेलेट थेरेपी चूहों को दिलाई गई31। हमने स्टेंट थ्रोम्बोसिस और रक्तस्राव के जोखिम के बीच संतुलन बनाने की कोशिश की और हमारे अध्ययन में क्लोपिडोग्रेल और हेपरिन को प्रशासित किया। हालांकि इससे स्टेंट थ्रोम्बोसिस का खतरा कम हो सकता है, जो चूहों के 4.76% में हुआ था, यह भी आंतरिक रक्तस्राव या पोत बंद विफलता के कारण रक्तस्राव (चूहों के 9.52%) के तुलनात्मक रूप से अधिक जोखिम का कारण हो सकता है।
यहां, हमने चूहे के पेट के महाधमनी में दवा-eluting स्टेंट के प्रत्यारोपण का प्रदर्शन किया, लेकिन इसी तरह इस विधि का उपयोग अन्य, इसी तरह आकार के स्टेंट उपकरणों के मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए नंगे धातु स्टेंट या बायोरेसोबेबल वैस्कुलर मचान।
संक्षेप में, पेट महाधमनी स्टेंट प्रत्यारोपण के बाद आईएसआर की जांच करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रजनन योग्य मॉडल है। मॉडल को पुराने चूहों के उपयोग तक बढ़ाया जा सकता है, जो अनायास एथेरोस्क्लेरोटिक घावों को विकसित करने की अधिक संभावना रखते हैं, और मानव कोरोनरी हस्तक्षेप के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य उपकरणों का परीक्षण करके।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम एम्बेडिंग और स्लाइड उत्पादन के साथ उसकी अमूल्य तकनीकी सहायता के लिए श्रीमती एंजेला Freund शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम प्रयोगशाला पशु विज्ञान और प्रायोगिक सर्जरी संस्थान में श्री तादेज़ स्टॉपिंस्की को पशु चिकित्सा कार्य के साथ उनकी व्यावहारिक मदद के लिए भी धन्यवाद देना चाहेंगे ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
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