Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu
Summary
Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.
Abstract
Fare embriyonik kök hücrelerinin nöronal soylara kült haline alınması ve ayırt edilmesi için adım adım prosedürü ve ardından farklılaştırılmış hücreleri karakterize etmek için bir dizi tahlil açıklıyoruz. E14 fare embriyonik kök hücreleri, asılı bırakma yöntemiyle embriyoid cisimleri oluşturmak için kullanıldı ve daha sonra retinoik asit ile nöral progenitör hücrelere farklılaşmaya teşvik edildi ve son olarak nöronlara farklılaştı. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve immünofluoresans deneyleri, nöral progenitörlerin ve nöronların sırasıyla 8 ve 12. Sox1 promotör güdümlü bir GFP muhabirini ifade eden bir E14 hattında yapılan akış sitometrisi deneyleri, 8. günde hücrelerin yaklaşık% 60’ının GFP pozitif olduğunu ve bu aşamada nöral progenitör hücrelerin başarılı farklılığını gösterdiğini göstermiştir. Son olarak, küresel transkriptomik değişikliklerin profilini çıkarmak için RNA-seq analizi kullanılmıştır. Bu yöntemler, nöronal farklılaşma sırasında hücre kimliği geçişini düzenlemede belirli genlerin ve yolların katılımını analiz etmek için yararlıdır.
Introduction
Gelişmekte olan fare blastosistlerinin iç hücre kütlesinden ilk türetmelerinden bu yana1,2, fare embriyonik kök hücreleri (mESC) kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmayı incelemek için güçlü araçlar olarak kullanılmıştır3. Ayrıca, mESC farklılaşması, nörodejeneratif bozukluklar gibi hastalıkların tedavisinde kök hücre bazlı tedavide verimliliği ve güvenliği artırabilecek moleküler mekanizmaların muazzam bir şekilde anlaşılmasına yol açar4. Hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, bu in vitro sistem pratik ve değerlendirmede basitlik, hayvanların aksine hücre hatlarının bakımında düşük maliyet ve genetik manipülasyonlarda göreceli kolaylık gibi birçok avantaj sağlar. Bununla birlikte, farklılaştırılmış hücre türlerinin verimliliği ve kalitesi genellikle farklı mESC çizgilerinin yanı sıra farklılaşma yöntemlerinden etkilenir5,6. Ayrıca, farklılaşma verimliliğini değerlendirmek için geleneksel tahliller, sağlamlıktan yoksun olan seçilmiş marker genlerinin nitel incelemesine dayanır ve bu nedenle gen ifadesindeki küresel değişiklikleri kavrayamazlar.
Burada nöronal farklılaşmanın sistematik olarak değerlendirilmesi için bir dizi tahlil kullanmayı hedefliyoruz. Seçilen belirteçlerde hem geleneksel in vitro analizleri hem de RNA-seq kullanarak, bu süreçteki transkriptomik değişikliklerin yanı sıra farklılaşma verimliliğinin ölçümü için bir platform oluşturuyoruz. Daha önce belirlenmiş bir protokol7‘ye dayanarak, asma damla tekniği ile embriyoid cisimleri (EBs) oluşturduk, ardından daha sonra nöral indüksiyon ortamına sahip nöronlara farklılaştırılmış olan nöral progenitör hücreler (NPC’ ler) oluşturmak için suprafizyolojik retinoik asit (RA) kullanarak indüksiyon oluşturduk. Farklılaşmanın verimliliğini incelemek için, geleneksel RT-qPCR ve immünofluoresans (IF) testlerine ek olarak, RNA-seq ve akış sitometrisi gerçekleştirdik. Bu analizler, aşamaya özgü farklılaşmanın ilerlemesinin kapsamlı bir ölçümünü sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fare embriyonik kök hücrelerinin sinirsel farklılaşması için yöntem onlarca yıldır oluşturulmuştur ve araştırmacılar önceki protokolleri değiştirmeye veya çeşitli amaçlar için yenilerini oluşturmaya devam etmişlerdir7,10,11. MESC’lerin nöronlara farklılaşma aşamalarının verimliliğini ve ilerlemesini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için bir dizi tahlil kullandık, bu da fare veya insan ESC’lerin…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH’den (1R35GM133496-01) Z. Gao’ya verilen bir hibe ile desteklendi. Bölümlemedeki yardımları için Dr. Ryan Hobbs’a teşekkür ederiz. Penn State College of Medicine’ın Genom Bilimleri ve Biyoinformatik, İleri Işık MikroskopiSi Görüntüleme ve Akış Sitometrisi gibi temel tesislerine teşekkür ediyoruz. Ayrıca RNA-seq analizindeki yardımları için Dr. Yuka Imamura’ya teşekkür ederiz.
Materials
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| – Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| – Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| – Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| – Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
Referenzen
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O’Brien, N., Bourke, J., O’Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
