Desvendando o papel das áreas discretas do cérebro de rato na regulação da ovulação através da inativação reversível por microinjeções de tetrodotoxinas
Summary
Este protocolo descreve a construção de um sistema de microinjeção de baixo custo, sua implantação estereotaxa em estruturas cerebrais profundas e o procedimento para microinjeções cronometradas de tetrodotoxina em ratos acordados e desenfreados. O objetivo é revelar a participação de estruturas hipotalâmicas na regulação da ovulação inibindo sua atividade neural.
Abstract
Muitas abordagens experimentais têm sido usadas para estudar o papel do cérebro na regulação da ovulação. Exemplos incluem a lesão e a desafeção de grupos neuronais, que são métodos invasivos que prejudicam permanentemente a integridade da área alvo. Esses métodos são acompanhados de efeitos colaterais que podem afetar a análise de mecanismos regulatórios agudos e temporais. A implantação estereotipada de cânulas-guia destinadas a regiões cerebrais específicas, seguidas de um período de recuperação, permite aos pesquisadores microinjetar diferentes drogas após o desaparecimento dos efeitos indesejados da cirurgia. A tetrodotoxina tem sido usada para determinar os papéis de várias áreas cerebrais em diversos processos fisiológicos, pois inibe transitoriamente os potenciais de ação dependentes de sódio, bloqueando assim toda a atividade neural na região alvo. Este protocolo combina este método com estratégias para a avaliação do ciclo estrous e da ovulação para revelar o papel de regiões cerebrais discretas na regulação da ovulação em determinados momentos de qualquer estágio do ciclo estrous. Ratos acordados e desenfreados(Rattus norvegicus) foram usados para evitar os efeitos de bloqueio que os anestésicos e os hormônios do estresse exercem sobre a ovulação. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a outras espécies, alvos cerebrais e agentes farmacológicos para estudar diferentes processos fisiológicos. Melhorias futuras neste método incluem o projeto de um sistema de microinjeção usando capilares de vidro de pequeno diâmetro em vez de cânulas-guia. Isso reduzirá a quantidade de tecido danificado durante a implantação e diminuirá a disseminação das drogas infundidas fora da área alvo.
Introduction
A ovulação é o processo pelo qual um ou mais oócitos maduros são liberados dos ovários uma vez que cada ciclo estral/menstrual. Como todas as espécies de mamíferos dependem da produção de gametas para procriar, a compreensão dos mecanismos que regulam a ovulação tem um enorme impacto em áreas que vão da biomedicina, da pecuária e da manutenção de espécies ameaçadas de extinção. A ovulação é regulada pelo eixo hipotalâmico-pituitário-ovariano, que envolve várias áreas hipotalâmicas e extra-hipotalâmicas, os gonadotropes na hipófise anterior e as células trómia e granulosa que, juntamente com os oócitos, formam os folículos ovarianos dentro dos ovários1.
Os folículos ovarianos crescem, desenvolvem-se e eventualmente ovulam em resposta à secreção tônica e afásica do hormônio estimulante do folículo e do hormônio luteinizador, os dois gonadotropinas secretados pelos gonadotropos. O padrão de secreção de gonadotropina é fundamental para o desenvolvimento folicular adequado e a ovulação e é regulado pelo hormônio liberador de gonadotropina (GnRH)1,2. Este neuropeptídeo é sintetizado por neurônios espalhados pelo diencephalon basal e, em seguida, secretado para a vasculatura portal que liga o hipotálamo e a hipófise anterior. A atividade secreta dos neurônios GnRH é, por sua vez, modulada pela entrada sináptica decorrente de diversas estruturas cerebrais. Essas estruturas transmitem informações sobre o estado do ambiente externo e interno do organismo, incluindo a disponibilidade de alimentos, o comprimento do fotoperíodo e a concentração de hormônios no sangue. Nesse sentido, eles moldam o padrão reprodutivo de cada espécie e os papéis específicos dessas estruturas devem ser determinados para compreender adequadamente os mecanismos que regem a ovulação. Como exemplo, foi demonstrado que a flutuação nos níveis de estradiol durante o ciclo estrous regula a secreção do GnRH; no entanto, os neurônios GnRH não expressam a isoforme do receptor estradiol necessário para detectar tais alterações. Duas populações de neurônios expressando esses receptores estão localizadas na região periventricular rostral do terceiro ventrículo e no núcleo arcuato, respectivamente, e sinapses stablish com neurônios GnRH. Há evidências que sugerem que esses neurônios interpretam a concentração de estradiol e, em seguida, estimulam a atividade de neurônios GnRH liberando kisspepíntina, um potente indutor da secreção GnRH3.
Experimentos envolvendo lesões hemicas ou químicas, bem como a desafetração mecânica, permitiram aos pesquisadores determinar o envolvimento de várias estruturas cerebrais na regulação da ovulação4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Esses experimentos, no entanto, têm a desvantagem de serem invasivos e traumáticos, exigindo vários dias de recuperação antes de avaliar os efeitos do tratamento, impedindo a análise dos efeitos agudos do tratamento. Além disso, afetam permanentemente as áreas alvo e interrompem outros processos fisiológicos a longo prazo. Devido a esses problemas, os resultados desses experimentos são geralmente obscurecidos pelos mecanismos compensatórios homeostáticos no corpo do animal e extrair informações precisas sobre a dinâmica regulatória temporal em que a área está envolvida é bastante difícil.
A microinjeção de drogas que interrompem transitóriamente a atividade dos neurônios através de cânulas guia é uma alternativa adequada que supera as desvantagens mencionadas acima. As cânulas podem ser colocadas em qualquer região cerebral por uma cirurgia estereotaxa, permitindo que o pesquisador inicie o tratamento medicamentoso após os efeitos confusos da cirurgia desaparecerem. A microinjeção cronometrada dos medicamentos permite que os pesquisadores testem hipóteses sobre a contribuição da região para uma determinada etapa do processo e podem ser realizadas em animais acordados ou em movimento livre. Uma variedade de drogas, incluindo anestésicos locais, agonistas, antagonistas, agonistas inversos e toxinas biológicas como a tetrodotoxina (TTX) podem ser microinjetadas na região de interesse em momentos específicos.
TTX é uma toxina biológica sintetizada por bactérias que vivem no corpo do baiacu, bem como outros vertebrados e invertebrados. O TTX silencia a atividade neural através do bloqueio seletivo e transitório dos canais de sódio, o que resulta na inibição dos potenciais de ação dependentes do sódio. Na presença do TTX, as células experimentam uma alteração na fase de despolarização e, portanto, não são excitáveis, mas permanecem vivas. O efeito de bloqueio do TTX é explicado por sua composição molecular: um grupo de guanidinium é capaz de passar pelo aspecto extracelular do canal de sódio, mas o resto da molécula não pode passar devido ao seu tamanho, por isso fica preso e bloqueia o canal13,14,15,16,17 . O mecanismo de ação do TTX permitiu seu uso como ferramenta para estudar o sistema nervoso tanto in vitro quanto in vivo. A injeção intracerebral dessa toxina tem sido usada para estudar o papel de áreas cerebrais discretas em diversos processos como retenção de memória18, sono e excitação19,reconhecimento do local20,navegação espacial21,abuso de drogas22,termoregulação23,desenvolvimento da esquizofrenia24, comportamento sexual25 e regulação da ovulação26 entre outros. Neste protocolo descrevemos os efeitos na ovulação da inativação transitória de núcleos hipotalâmicos por microinjeção TTX em ratos acordados e desenfreados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um método para inativar transitoriamente, a qualquer momento, uma região discreta no cérebro de ratos acordados e sem restrições. Um método simples para rastrear seu ciclo estrous e avaliar a ovulação também é fornecido. Este protocolo permite uma análise direta da contribuição de regiões cerebrais específicas aos mecanismos que impulsionam a ovulação, comparando o desfecho ovulatório de animais tratados com TTX com os tratados com veículos. Com exceção do instrumento estereotaxi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Raymond Sanchez na Universidade de Washington por sua valiosa ajuda na edição de manuscritos e à M.Sc. Georgina Cortés e M.Sc. Cintia Javier por seu apoio técnico na padronização desta técnica. Também somos gratos aos membros dos serviços veterinários da Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández e MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán pela excelente manutenção e cuidado de animais experimentais. Os experimentos descritos neste protocolo foram apoiados pelo número de subvenção DGAPA-PAPIIT: IN216015 e pelo número de subvenção do CONACyT: 236908 a Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva é doutorando pelo Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e é apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Grant: 294555).
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
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