Obtención de osteocitos primarios mediante fraccionamiento calvarial murino de osteocitos que expresan GFP
Summary
Este protocolo describe la disección de calvaria de ratón dmp1-topacio neonatal y el aislamiento de osteocitos que expresan la proteína verde fluorescente a través de la digestión celular y el fraccionamiento, además de la preparación de osteocitos para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Abstract
El osteocito, que una vez se pensó que era un residente pasivo del hueso dada la función detrás del escenario de detectar la carga mecánica, ahora se pone en el centro de atención y se ha demostrado que tiene múltiples funciones principales, como modificar activamente la matriz extracelular y formar un órgano endocrino con el sistema lacunocanalicular que lo encierra enviando mensajes a sitios distantes. Debido a los métodos que permitieron probar el osteocito in vitro desde el aislamiento de osteocitos primarios hasta líneas celulares similares a los osteocitos, los osteocitos están experimentando un interés rotundo y una oleada de conocimiento sobre estructura y función. Muchos aspectos de la biología de los osteocitos y la interacción con otros componentes moleculares aún no se han descubierto. En este protocolo, describimos en detalle el aislamiento eficiente de osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal dmp1-topacio, que expresan la proteína verde fluorescente en los osteocitos, mediante fraccionamiento celular y posteriormente adquiriendo cultivos de osteocitos primarios por FACS.
Introduction
Los osteocitos son células terminalmente diferenciadas de progenitores osteoblásticos que se incrustaron en su matriz secretada1. Son las células más abundantes y longevas entre las poblaciones de células óseas. Residen dentro de lagunas y tienen una morfología estrellada característica con dendritas que se extienden a través de canales llamados canalículos formando una extensa red de comunicación e intercambio metabólico con su entorno circundante y la superficie ósea2. Los osteocitos coreografian tanto osteoblastos como osteoclastos en la remodelación ósea, son las células mecanosensoriales primarias que confieren adaptación a la carga mecánica3, intervienen en la homeostasis del fosfato4 y en la mineralización de la matriz ósea5, y junto con el sistema lacunocanalicular, actúan como órgano endocrino que señala tejidos distantes6.
Los osteocitos están situados dentro de una matriz mineralizada, lo que limita la accesibilidad y dificulta su aislamiento, lo que dificulta la investigación in vitro. Uno de los primeros métodos de aislamiento describió osteocitos aislados de calvaria de pollo utilizando un anticuerpo monoclonal específico de osteocitos (OB7.3)7 que más tarde se supo que era la variante aviar de PHEX (gen regulador de PHosphate con homología a endopeptidasas en el cromosoma X)8. Otros investigadores utilizaron la digestión secuencial de huesos largos de rata 9 o ratón 10 para obtener fracciones ricas en osteocitos en las que se informó que la pureza de los osteocitos era de alrededor del70%9. Las limitaciones de este procedimiento incluyen la pureza subóptima de los cultivos contaminados con otros tipos de células además de los osteocitos y que los osteocitos podrían ser potencialmente sobrecultivados por otras células en cultivo ya que los osteocitos han perdido la capacidad de dividirse. Estos desafíos restringen la usabilidad de las culturas a largo plazo.
Para superar estas limitaciones, se desarrollaron diferentes líneas celulares de osteocitos. La línea celular MLO-Y411 y la línea celular MLO-A512 son, en particular, las líneas celulares más estudiadas que son útiles para el estudio de los osteocitos en etapa temprana; sin embargo, son menos útiles para estudiar la señalización de osteocitos maduros, ya que expresan bajos niveles de esclerostina y FGF2313, los cuales son marcadores de osteocitos maduros. Otras líneas celulares, incluidas IDG-SW314 y Ocy45415, expresan altos niveles de esclerostina y FGF23 y son útiles para estudiar la etapa tardía de osteocitos. Las líneas celulares demuestran ser herramientas de investigación útiles; Sin embargo, no vienen sin limitaciones, ya que no representan completamente la biología de la célula primaria. Diferentes líneas celulares representan diferentes etapas de desarrollo del espectro de madurez de los osteocitos, y las líneas celulares no representan la heterogeneidad de los osteocitos primarios16,17.
Para obtener cultivos puros de osteocitos primarios, los investigadores aprovecharon el modelo de ratón cre en el que se utiliza el promotor dmp1 de 8 kb para impulsar la expresión de proteína fluorescente verde (GFP) en osteocitos18,19. Para obtener poblaciones de osteocitos se han utilizado ratones transgénicos duales (pOB-Col 2.3-GFP-cian y DMP1-GFP-topaz) por Paic et al.19 y ratones transgénicos dmp1-topacio por Nakashima et al.20. En el que emplearon digestión secuencial y FACS de osteocitos que expresan GFP para adquirir cultivos de osteocitos primarios19,20. Se demostró que la dirección de cre en el ratón reportero dmp1 de 10 kb Ai9, que activa la proteína tdTomato, está presente en osteocitos, osteoblastos, músculos y células dentro de la médula ósea. El promotor dmp1 de 8 kb tenía el mismo patrón de expresión, pero sólo una proporción de osteoblastos y células de médula ósea expresaba la proteína, lo que indica que el promotor dmp1 de 8 kb es más específico21. A pesar de esto, los resultados obtenidos utilizando el promotor dmp1 de 8 kb deben interpretarse con precaución, y los perfiles de expresión génica deben llevarse a cabo de forma rutinaria utilizando marcadores específicos de osteocitos frente a osteoblastos para garantizar que la población obtenida sea de pureza lo suficientemente alta.
Los marcadores de osteoclastos OSCAR y Dcstamp se encontraron en poblaciones hematopoyéticas de osteocitos no agotados frente a poblaciones de osteocitos agotados, este hallazgo llevó a los autores a concluir que los digerios obtenidos del fraccionamiento de la calvaria neonatal de 8 kb dmp1-topacio y la clasificación de GFP están contaminados con células hematopoyéticas. La contaminación con células hematopoyéticas podría haberse mitigado apretando la puerta de clasificación de GFP, ya que las células hematopoyéticas positivas para GFP tenían una intensidad de GFP razonablemente menor que las células mesenquimales positivas para GFP (osteocitos)22.
Los métodos para estudiar los osteocitos in vitro han contribuido a la reciente riqueza de información sobre la biología de los osteocitos. Sin embargo, el aislamiento de osteocitos sigue siendo un procedimiento laborioso y prolongado con bajos rendimientos celulares. El método descrito de digestión ósea utilizando colagenasa y EDTA a menudo hasta la fracción 823, toma varias horas en las que se grava la viabilidad de los osteocitos. Los investigadores han reportado el uso de fracciones (2-20125) para la clasificación celular 20, y han demostrado que el perfil de expresión de genes asociados con los osteocitos frente a los de los osteoblastos confirma el éxito de aislar poblaciones de osteocitos puros20. En este artículo, describimos el proceso de obtención de fracciones (2-0125), y comparamos el rendimiento de los osteocitos de cada fracción comenzando con la fracción 1 a la 8 para determinar el retorno de los osteocitos en cada fracción. También describimos la disección de la calvaria del ratón dmp1-topacio recién nacido y la digestión calvarial utilizando colagenasa y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), así como la preparación de células para FACS.
Protocol
Representative Results
Discussion
El primer osteocito aislado fue de una calvaria de pollo 7 aislada mediante el uso (OB7.3) o la variante aviantede PHEX; Sin embargo, este método está limitado por la disponibilidad de anticuerpos viables, ya que se deben fabricar anticuerpos específicos de osteocitos que también son específicos de la especie. Los investigadores utilizaron una modificación diferente del proceso enzimático secuencial para obtener osteocitos de huesos largos de ratón y rata; La pureza reportada de estas cult…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención JSPS KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (No. 19K10397 a H.K. y No. 18K09862 a I.M.).
Materials
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
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