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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

CRISPR-मध्यस्थता आधार संपादकों का उपयोग कर BRCA1 वेरिएंट का कार्यात्मक मूल्यांकन

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

BRCA1 म्यूटेशन वाले लोगों में कैंसर विकसित होने का खतरा अधिक होता है, जो बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्य के सटीक मूल्यांकन का वारंट देता है। इसके साथ ही, हमने CRISPR-मध्यस्थता साइटोसाइन बेस एडिटर का उपयोग करके बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया जो लक्षित सी: जी से टी: जीवित कोशिकाओं में रूपांतरण को सक्षम करता है।

Abstract

हाल के अध्ययनों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर परख, भ्रूणस्टेम सेल व्यवहार्यता परख, और चिकित्सीय दवा आधारित संवेदनशीलता परख जैसे विभिन्न कार्यात्मक मूल्यांकन विधियों का उपयोग करके बीआरसीए1 जीन म्यूटेशन से जुड़े जोखिमों की जांच की गई है। हालांकि उन्होंने बहुत सारे बीआरसीए1 वेरिएंट को स्पष्ट किया है, लेकिन एक्सोजेनोसली व्यक्त किए गए बीआरसीए1 वेरिएंट के उपयोग से जुड़े ये परखें अतिव्यक्तता के मुद्दों से जुड़ी हुई हैं और उन्हें पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन पर लागू नहीं किया जा सकता है । इन सीमाओं को हल करने के लिए, हमने पहले CRISPR-मध्यस्थता साइटोसाइन बेस एडिटर के माध्यम से बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि की सूचना दी जो जीवित कोशिकाओं में लक्षित न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन को प्रेरित करती है। इस विधि का उपयोग करके, हमने उन वेरिएंट की पहचान की जिनके कार्य अस्पष्ट रहते हैं, सी-97सी और जीटी;टी, सी.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T, और c.4986+5G>A, और पुष्टि की है कि CRISPR-मध्यस्थता आधार संपादकों बीआरसीए1में अनिश्चित महत्व के वेरिएंट को फिर से वर्गीकृत करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं । यहां, हम CRISPR-आधार पर साइटोसाइन बेस एडिटर का उपयोग करके बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल लक्ष्य साइटों के चयन, कार्यात्मक विश्लेषण और बीआरसीए1 वेरिएंट के मूल्यांकन के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है।

Introduction

स्तन कैंसर प्रकार 1 संवेदनशीलता जीन(BRCA1)एक व्यापक रूप से ज्ञात ट्यूमर दबाने वाला जीन है। क्योंकि BRCA1 जीन डीएनए क्षति की मरम्मत से संबंधित है, इस जीन में उत्परिवर्तन एक व्यक्ति1में कैंसर के विकास का एक बड़ा खतरा पैदा होगा । स्तन, अंडाशय, प्रोस्टेट, और अग्नाशय के कैंसर बीआरसीए1 जीन 2 के विरासत में मिले नुकसान-समारोह (LOF) म्यूटेशन से जुड़ेहुएहैं । बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन और पहचान से विभिन्न बीमारियों को रोकने और उनका निदान करने में मदद मिल सकती है। बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्य को संबोधित करने के लिए, कई तरीकों को विकसित किया गया है और मोटे तौर पर बीआरसीए1 वेरिएंट जैसे भ्रूणस्टेम सेल व्यवहार्यता परख, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर परख, और चिकित्सीय दवा आधारित संवेदनशीलता परख3,4,5, 6की रोगजनकता की जांच के लिए उपयोग कियागयाहै। हालांकि इन तरीकों ने बहुत सारे बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्य का आकलन किया है, लेकिन एक्सोजेनोस द्वारा व्यक्त किए गए तरीकों ने बीआरसीए1 वेरिएंट को अतिव्यक्तिष्कता के संदर्भ में सीमाएं पैदा की हैं जो डाउनस्ट्रीम विनियमन, जीन खुराक और प्रोटीन फोल्डिंग7को प्रभावित कर सकती हैं। इसके अलावा, इन परखों का उपयोग पोस्टट्रांसक्रिप्शनल नियमन जैसे एमआरएनए स्प्लिसिंग, ट्रांसक्रिप्ट स्थिरता और अअनुवादित क्षेत्र8, 9के प्रभाव के लिए नहीं किया जासकताहै।

CRISPR-Cas9 प्रणाली जीवित कोशिकाओं और जीवों में लक्षित जीनोम संपादन सक्षम बनाता है10। एक एकल गाइड आरएनए के माध्यम से, Cas9 दो डीएनए मरम्मत मार्गों को सक्रिय करने के लिए विशिष्ट जीनोमिक लोकी पर गुणसूत्र डीएनए में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) को प्रेरित कर सकता है: त्रुटि-प्रवण गैर-होम्योपैथी अंत-जुड़ने (एनएचईजे) मार्ग और त्रुटि मुक्त होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग11। एचडीआर एक सटीक मरम्मत तंत्र है; हालांकि, एचडीआर के लिए Cas9 नाभिक द्वारा प्रेरित डीएसबी के परिणामस्वरूप अक्सर अवांछित प्रविष्टि और विलोपन (इंडेल) उत्परिवर्तन होता है। इसके अतिरिक्त, यह डीएनए क्षति की मरंमत के लिए अनुरूप दाता डीएनए टेम्पलेट्स की जरूरत है और अपेक्षाकृत कम दक्षता है । हाल ही में, Cas9 nickase (nCas9) सी को लक्षित करने के लिए साइटिडीन डेमानेस डोमेन के साथ जुड़ा हुआ है: जी से टी: एक प्रतिस्थापन, मुताबिक़ डीएनए टेम्पलेट्स और डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक12,13,14, 15की आवश्यकता के बिना। साइटोसाइन बेस एडिटर का उपयोग करके, हमने बीआरसीए1 वेरिएंट16के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक नई विधि विकसित की।

इस अध्ययन में, हमने CRISPR-मध्यस्थता साइटोसाइन बेस एडिटर, BE314का उपयोग किया, जो बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन को लागू करने के लिए कुशल सी:जी टू टी: ए पॉइंट म्यूटेशन को प्रेरित करता है और कई बीआरसीए1 वेरिएंट(चित्रा 1)के कार्यों की सफलतापूर्वक पहचान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए कार्यप्रवाह का अवलोकन। (ए) योजनाबद्ध बीआरसीए1के कार्यात्मक मूल्यांकन को दिखा रहा है । क्योंकि BRCA1 के LOF सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, जब BRCA1 उत्परिवर्तन रोगजनक है, कोशिकाओं को पारित होने की संख्या बढ़ जाती है के रूप में मर जाते हैं । (B) बीआरसीए1के कार्यात्मक मूल्यांकन के चरण । बिंदीदार बॉक्स वैकल्पिक है। इसे जीएनए एक्सप्रेसिंग और बीई3 के सह-ट्रांसफैक्शन द्वारा प्लेटमिड्स डीएनए व्यक्त करने से प्रतिस्थापित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

नोट: विधि 1 (HAP1-BE3 सेल लाइनों की पीढ़ी) वैकल्पिक है । BE3-एक्सप्रेसिंग सेल लाइन का निर्माण करने के बजाय, BE3-encoding प्लाज्मिड डीएनए को gRNA-encoding प्लाज्मिड डीएनए से सह-संक्रमित किया जा सकता है । साइटोसाइन बेस एडिटर्स के अन्य वेरिएंट, जैसे BE4max, का उपयोग अत्यधिक कुशल आधार संपादन के लिए भी किया जा सकता है।

1. HAP1-BE3 सेल लाइनों का उत्पादन

  1. प्लाज्मिड डीएनए का निर्माण
    1. लेंटीवायरस उत्पादन के लिए लेंटीबी3-ब्लास्ट प्लाज्मिड डीएनए का निर्माण करने के लिए, उच्च निष्ठा बहुलक का उपयोग करके पीसीआर द्वारा पीसीएमवी-बीई 3(सामग्री की तालिका)में BE3 कोडिंग दृश्यों को बढ़ाना। पीसीआर प्राइमर को डाइसोथमल असेंबली के लिए पचाने वाले वेक्टर (चरण 1.1.2 से) के ओवरलैपिंग दृश्यों को शामिल करने के लिए डिजाइनकरें:
      प्राइमर-एफ:5'-टीटीटीजीसीसीजीसीगाकेगागाग जीसीसीसीसीसीसीक्काग-3',
      प्राइमर-आर:5'-CAGAGAAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTCTCTTTGGG-3'
      नोट: रेखांकित में दिखाए गए न्यूक्लियोटिड्स पचाने वाले वेक्टर के साथ छा जाते हैं और ये दृश्य उपयोगकर्ता द्वारा चुने गए गंतव्य वेक्टर के लिए विशिष्ट होंगे।
    2. डाइजेस्ट लेंटीका9-ब्लास्ट(सामग्री की तालिका)प्रतिबंध एंजाइमों के साथ प्लाज्मिड डीएनए, XbaI और BamHI (1 इकाई प्रति 1 μg) 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए। 0.8% एगर उठे जेल पर पचाने वाले उत्पाद को चलाएं और एक वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके उपयुक्त आकार के बैंड (8.6 केबी) को शुद्ध करें।
    3. प्रवर्धित BE3 पीसीआर उत्पाद का क्लोन बनाएं और आइसोथेमल असेंबली किट(सामग्रियों की तालिका)का उपयोग करके लेंटीका9-ब्लास्ट वेक्टर को पचा लें। डीएनए टुकड़ों के कुल 0.02-0.5 बजेओल और वेक्टर के 1:3 अनुपात का उपयोग करें: डालें। 18DH5 अल्फा सक्षम कोशिकाओं में विधानसभा उत्पाद को बदलें । एम्पीसिलिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) युक्त एगर प्लेट पर ट्रांसफॉर्मेंट जोड़ें और प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. कई उपनिवेशों को चुनें और उन्हें एलबी (lysogeny शोरबा) माध्यम के 4 एमएल में टीका लगाएं जिसमें एम्पिसिलिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) होता है और 180 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में संस्कृति को विकसित करता है।
    5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड डीएनए शुद्धिकरण किट(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें।
    6. डीएनए क्लोनिंग सफलता की पुष्टि करने के लिए, मानक और BE3-विशिष्ट प्राइमर (अनुपूरक तालिका 1) का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण द्वारा प्रत्येक शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए (चरण1.1.5से) के BE3 दृश्यों का विश्लेषण करें और सटीक क्लोन किए गए लेंटीबी3-ब्लास्ट निर्माण का चयन करें।
      नोट: सेंगर अनुक्रमण के परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, हमने ब्लास्ट (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) और क्लूस्टलडब्ल्यू (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) जैसे कई उपकरणों की सिफारिश की।
  2. सेल संस्कृति और HAP1-BE3 सेल लाइनों की पीढ़ी
    1. कोशिकाओं को स्वस्थ स्थिति में और सक्रिय रूप से विभाजित करने वाली स्थिति में बनाए रखें। इस्कोव के संशोधित Dulbecco के माध्यम(सामग्री की तालिका)में संस्कृति HAP1 कोशिकाओं जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं । दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम(सामग्रीकी तालिका) में संस्कृति HEK293T/17 कोशिकाओं जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं ।
      नोट: HAP1 सेल आनुवंशिक अनुसंधान के लिए उपयोगी है क्योंकि यह लगभग हैप्लॉयड कोशिकाओं है । हालांकि, कोशिकाओं को अनायास सेल संस्कृति में एक diploid राज्य में लौट सकते हैं । संवर्धन Hoechst 34580 दाग 1n- प्रवाह का उपयोग कर जनसंख्या HAP1 कोशिकाओं के हैप्लाइडी के रखरखाव के लिए मददगार होगा19.
    2. बीज 5 x 106 HEK293T/17 कोशिकाओं पर एक १०० एनएम पकवान पर 1 दिन पहले ट्रांसफेक्शन । ट्रांसफेक्शन के दिन, निर्माता के प्रोटोकॉल(सामग्रीकी तालिका) 200 के अनुसार वाणिज्यिक ट्रांसफैक्शन रीजेंट्स का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए (लेंटीबी3-ब्लास्ट के 15 माइक्रोन, वायरल पैकेजिंग के लिए psPAX2 के 9 माइक्रोन, और2 पीढ़ी के लेंटीवायरल पैकेजिंग सिस्टम के शीशी लिफाफे के लिए pMD2.G के6माइक्रोन) को ट्रांसफेक्ट करें। मीडियम को 6 घंटे बाद बदलें ट्रांसफैक्शन और हार्वेस्ट वायरस युक्त मीडियम 48 घंटे या 72 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन पर। 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके सुपरनैंट को फ़िल्टर करें।
    3. 0.1 के एमओआई (संक्रमण की बहुलता) पर HAP1 कोशिकाओं में BE3 के लेंटीवायरल कणों को स्थानांतरित करें। एक उपयुक्त एमओआई के लिए समायोजित करने के लिए, वायरस की क्रमिक रूप से पतला सांद्रता का उपयोग करें। माध्यम को हटा दें और इसे समायोजित वायरल सुपरनेट और ताजा संस्कृति माध्यम से बदलें।
    4. ट्रांसडक्शन के एक दिन बाद, मध्यम को ब्लास्टिसिडिन(सामग्रीकी तालिका) के 10 μg/mL में बदलें-जिसमें मध्यम होता है और ब्लास्टिसिडिन के साथ 3 दिनों के लिए ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं का चयन करें । ब्लास्टिसिडिन चयन के बाद, अगले चरण के लिए ~ 10% जीवित कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से चयन करें।
    5. ब्लास्टिसिडिन चयन के बाद, एकल क्लोन को अलग करने के लिए 0.5 कोशिकाओं के घनत्व पर 96-अच्छी तरह से प्लेटों पर ट्रांसड्यूड कोशिकाओं को बीज करें (उदाहरण के लिए, 20 एमएल (0.5 कोशिकाओं प्रति 200 माइक्रोन) संस्कृति माध्यम और 96 अच्छी तरह से प्लेट में अलीकोट 200 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से पतला करें। 2 सप्ताह के लिए 96-अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें और बीई 3 गतिविधि की पुष्टि करने के लिए एकल उपनिवेशों को चुनें।
    6. एकल कालोनियों को दो सेटों में विभाजित करें, एक सेट BE3 गतिविधि के परीक्षण के लिए और रखरखाव के लिए अन्य। BE3 गतिविधि की पुष्टि करने के लिए जीआरएनए के लेंटीवायरल कणों को एक सेट में स्थानांतरित करें। टी 7 एंडोक्यूलीज I (T7E1, सामग्री की तालिका)परख या लक्षित गहरी अनुक्रमण तकनीक (चरण 4)21का उपयोग करके प्रत्येक कॉलोनी की उत्परिवर्तन आवृत्ति का विश्लेषण करें। उपयुक्त एकल क्लोन का चयन करें जो स्वस्थ हैं और एक अत्यधिक सक्रिय BE3 है।
      नोट: सटीक उत्परिवर्तन आवृत्तियों को मान्य करने के लिए, हम T7E1 परख की तुलना में लक्षित गहरी अनुक्रमण की सलाह देते हैं। HEK2 (5'-GAACACAAAATAGACTGGGGGG-'3) BE3 के लिए अच्छी तरह से मान्य लक्ष्य साइट है।

2. जीआरएएनए को लक्षित करते हुए बीआरसीए1 का डिजाइन और निर्माण

Figure 2
चित्रा 2: एक gRNA प्लाज्मिड डीएनए का एक उदाहरण है। (क)बीई 3 के साथ लक्ष्य अनुक्रम को प्रभावी ढंग से संपादित करने के लिए, एक एनजीजी पाम (सीसीएन पाम) जो लक्ष्य सी (लक्ष्य जी) को पांच-न्यूक्लियोटाइड विंडो के भीतर रखता है। एनजीजी पाम लाल रंग में दिखाया गया है और आधार संपादन खिड़की एक ग्रे बॉक्स द्वारा प्रतिनिधित्व किया है। (ख)सी.8047C>T (H1283Y) बेस एडिटिंग के लिए जीआरएनए सीक्वेंस दर्शाया गया है और टारगेट सी:जी जोड़े को लाल रंग में दिखाया गया है जबकि एक्टिव विंडो को ग्रे बॉक्स से हाइलाइट किया गया है । जीआरएनए क्लोनिंग के लिए, बोल्ड में इंगित ओवरहांग दृश्यों को दोनों 5 सिरों पर जोड़ा जाता है। जीआरएनए के लिए टेम्पलेट्स दो पूरक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को एनीलिंग करके उत्पन्न किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: बीआरसीए1 वेरिएंट के सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण आवश्यक हैं। इस अध्ययन में, सी.5252G>A (R1751Q) और c.4527C>T (Y1509Y) सौम्य नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। c.191G>A (C64Y), 81-1G>A, और c.3598C>T (Q1200*) का उपयोग रोगजनक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। प्रत्येक जीएनए के लक्ष्य दृश्यों को अनुपूरक तालिका 1में सूचीबद्ध किया गया है।

  1. एनसीबीआई22में जेनबैंक से बीआरसीए1 जीनोम अनुक्रम प्राप्त करें ।
  2. प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पाम) अनुक्रम "NGG" और ब्याज के उत्परिवर्तन के आसपास "CCN" के साथ 20 बीपी लक्ष्य साइटों को खोजें । ब्याज का उत्परिवर्तन जीएनए लक्ष्य दृश्यों के पाम-डिस्टल अंत में 4-8 न्यूक्लियोटाइड में स्थित होना चाहिए क्योंकि बीई 3 की सक्रिय खिड़की जीआरएनए लक्ष्य दृश्यों के पाम-डिस्टल अंत में4-8न्यूक्लियोटाइड 14 है। सी.8047C>T (H1283Y) और c.5252G>A (R1751Q) के मामले में- जीआरएएनए, 5-टीसीएजीगाएसीएटीसीसीटीटीजी-एजीजी-3 और 5-सीसीएजीजीसीएएएजीसीजीजीए-3,एक्टिव विंडोज में सीक्वेंस हैं। सी टू टी और जी टू कन्वर्जन क्रमशः एनजीजी और सीसीएन पाम(चित्रा 2 ए)के साथ होते हैं।
    नोट: बीई-डिजाइनर (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 जीआरएनए डिजाइन के लिए उपयोगी वेब-आधारित उपकरण है।
  3. प्रति जीआरएनए दो पूरक ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स ऑर्डर करें; फॉरवर्ड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए, गाइड अनुक्रम के 5 अंत में "CACCG" जोड़ें, और रिवर्स ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए, 5 के अंत में "एएएसी" जोड़ें और 3' के अंत में "सी" जोड़ें। ये अतिरिक्त दृश्य इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले गंतव्य जीआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर (चरण 2.5 से) के लिए विशिष्ट हैं, और उपयोगकर्ताओं को वैकल्पिक जीआरएनए अभिव्यक्ति वैक्टर(चित्रा 2 बी)के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
  4. आसुत जल में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को 100 माइक्रोन की अंतिम सांद्रता पर फिर से रखें। दो पूरक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को टी 4 लिगेशन बफर(सामग्री की तालिका)के साथ 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में मिलाएं और उन्हें 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और उन्हें एनीमलिंग के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस (सामग्री की तालिका) पर 1 घंटे के लिए प्रतिबंध एंजाइम, बीएसएआई (1 यूनिट प्रति 1 माइक्रोग्राम) का उपयोग करके PRG2को पचाएं। 1% एगर उठे जेल पर पचा उत्पाद चलाएं और उचित आकार के बैंड (2.5 केबी) को शुद्ध करें।
    नोट: क्लासिक पाचन और लिगेशन विधि का उपयोग करने के बजाय, गोल्डन गेट क्लोनिंग जैसी अन्य क्लोनिंग विधि का उपयोग किया जा सकता है।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार खरीदे गए डीएनए लिगाज़(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके वेक्टर डीएनए के लिए एनील्ड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डुप्लेक्स को लिगेट करें और उन्हें डीएच 5 अल्फा-सक्षम कोशिकाओं (अन्य ई. कोलाई उपभेदों जो व्यापक रूप से उपक्लेमनिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं) में बदल दें।
  7. एम्पीसिलिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) युक्त एगर प्लेट में ट्रांसफॉर्मेंट जोड़ें और प्लेट को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कई ट्रांसफॉर्मेंट से प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें और यू 6 प्रमोटर(सामग्री की तालिका)में प्राइम का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण द्वारा अपने जीआरएनए दृश्यों का विश्लेषण करें।

3. CRISPR-मध्यस्थता आधार संपादन उपकरण का उपयोग कर BRCA1 वेरिएंट का निर्माण

नोट: यदि HAP1-BE3 सेल लाइनों का उपयोग नहीं किया जाता है, BE3-encoding प्लाज्मिड डीएनए बीआरसीए1-लक्षितgRNA के साथ सह संक्रमित किया जा सकता है । BE3 और gRNA प्लाज्मिड के सह-ट्रांसफैक्शन की तुलना में, जीआरएनए प्लाज्मिड का हैप-बीई 3 कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन हमारे हाथों में लक्ष्य लोकस पर 3 गुना तक कुशल आधार संपादन को प्रेरित करता है।

  1. बीज 5 x 105 HAP1-BE3 कोशिकाओं (या सह-ट्रांसफैक्शन विधियों के मामले में HAP1 कोशिकाओं) प्रति अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से प्लेटों में 1 दिन ट्रांसफैक्शन से पहले। ट्रांसफेक्शन के समय, संस्कृति कोशिकाएं उचित घनत्व (70%-80% संगम) तक पहुंचने के लिए।
  2. निर्माता केप्रोटोकॉल के अनुसार खरीदे गए ट्रांसफैक्शन रिएजेंट्स(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके जीआरएएनए को लक्षित करना। बीआरसीए1के 1 माइक्रोन का उपयोग करें - जीआरएएनए को लक्षित करना (सह-ट्रांसफेक्शन विधियों के मामले में बीई 3-एन्कोडिंग प्लाज्मिड डीएनए के 1 माइक्रोन के साथ) सी:जी टू टी: बीआरसीए1 लक्ष्य साइटों पर रूपांतरण को प्रेरित करने के लिए। कोशिकाओं को हर 3-4 दिनों में 37 डिग्री सेल्सियस और उपसंस्कृति पर इनक्यूबेट करें।
  3. आधार संपादन क्षमता का विश्लेषण करने के लिए ट्रांसफैक्शन के 3, 10 और 24 दिनों के बाद सेल छर्रों को काटा जाए (ट्रांसफेक्शन के बाद 3 दिनों से नमूनों को दिन 0 नमूनों के रूप में पुनर्ग्रेडिंग का विश्लेषण किया जाता है)।
  4. जीनोमिक डीएनए शुद्धिकरण किट(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके जीनोमिक डीएनए निकालें।
    नोट: हम डीएनए के लिए अभिकर् चर के चर अनुपात के साथ ट्रांसफैक्शन स्थितियों को अनुकूलित करने की सलाह देते हैं। HAP1 ट्रांसफैक्शन के लिए इष्टतम स्थिति हमारे हाथों में डीएनए को रिएजेंट का 4:1 राशन है।

4. इलुमिना अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के लिए नमूना तैयारी

Figure 3
चित्रा 3: अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए तैयारी। 1सेंट पीसीआर प्राइमर जीनोमिक डीएनए पर बीआरसीए1 लक्ष्य स्थल को बढ़ाने के लिए डिजाइन किया गया था । 2 पीसीआर प्राइमर को इस तरह डिजाइन किया गया था किइसके सीक्वेंस 1पर्सेंट पीसीआर प्राइमर सीक्वेंस से ज्यादा अंदर स्थित हैं । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के प्रदर्शन के लिए आवश्यक दृश्यों को संलग्न करने के लिए2 पीसीआर प्राइमर के दोनों सिरों पर पीले बार के रूप में दिखाए गए अतिरिक्त दृश्यों को जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. बीआरसीए1 लक्ष्य साइटों को बढ़ाने के लिए 1सेंट पीसीआर प्राइमर डिजाइन करें। यद्यपि 1अनुसूचित पीसीआर उत्पाद के आकार पर कोई प्रतिबंध नहीं है, लेकिन एक विशिष्ट क्षेत्र(चित्र 3)को कुशलतापूर्वक बढ़ाने के लिए & 1 केबी के उत्पाद आकार की सिफारिश की जाती है।
  2. 1सेंट पीसीआर प्रोडक्ट के अंदर स्थित 2पीसीआर प्राइमर डिजाइन करें। एनजीएस रीड लेंथ के अनुसार एम्प्लिकॉन के आकार पर विचार करें (उदाहरण के लिए, एम्प्लिकॉन उत्पाद का आकार 2 × 150 बीपी पेयड-एंड रन के लिए 300 बीपी से छोटा होना चाहिए ताकि प्रत्येक पढ़ता है विलय किया जा सके)। एनजीएस विश्लेषण के लिए आवश्यक दृश्यों को संलग्न करने के लिए, 2पीसीआर प्राइमर के 5 ' अंत में अतिरिक्त दृश्यों को जोड़ें: फॉरवर्ड प्राइमर के लिए, 5'-ACACTCTCTCCCTACCGTCTCTC-3' दृश्यों को 5 ' अंत में जोड़ें, और रिवर्स प्राइमर के लिए, 5'-GTGACTGGGATCAGACGTGTCTCTCTCG ATCT-3 ' दृश्यों को 5 ' अंत में जोड़ें ।
    नोट: हमने प्राइमर को गैर-लक्षित अनुक्रम से संलग्न होने से रोककर गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के एम्प्लिकॉन को कम करने के लिए नेस्टेड पीसीआर का उपयोग किया।
  3. तीन समय अंक से प्राप्त जीनोमिक डीएनए पर बीआरसीए1 लक्ष्य स्थलों को बढ़ाना । पीसीआर त्रुटियों को कम करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार उच्च निष्ठा बहुलक का उपयोग करें। 1अनुसूचित पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, 15 चक्रों से अधिक प्रवर्धन के लिए जीनोमिक डीएनए के १०० एनजी का उपयोग करें । 2 पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, 20 चक्रों से अधिक प्रवर्धन के लिए 1सेंट पीसीआर उत्पाद के 1 माइक्रोल का उपयोग करें। 2% एगर उठे जेल पर 2 nd पीसीआर उत्पाद के 5माइक्रोन चलाएं और आकार की पुष्टि करें।
  4. एनजीएस विश्लेषण के लिए आवश्यक दृश्यों को संलग्न करने के लिए, नीचे सूचीबद्ध प्राइमर का उपयोग करके2 पीसीआर उत्पाद को बढ़ाना। पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, 2 पीसीआर उत्पाद के 1μL उच्च निष्ठा बहुलक का उपयोग कर 30 चक्रों तक प्रवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    1. बड़ी संख्या में पुस्तकालयों को एक साथ पूल और अनुक्रमित करने के लिए मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण करने के लिए, आगे (D501 - D508) और रिवर्स (D701 - D712) प्राइमर का उपयोग करें, जिसमें अद्वितीय सूचकांक अनुक्रम(अनुपूरक तालिका 1)है। अद्वितीय दोहरी अनुक्रमण रणनीति का संचालन करने के लिए विभिन्न प्राइमर सेट का उपयोग करके प्रत्येक नमूने को बढ़ाना।
    2. आकार की पुष्टि करने के लिए 2% एगर उठे जेल पर पीसीआर उत्पाद के 5 माइक्रोन चलाएं, और एक वाणिज्यिक पीसीआर क्लीन-अप किट(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके एम्प्लिकॉन को शुद्ध करें। एक NGS पुस्तकालय बनाने के लिए समान मात्रा में प्रत्येक नमूने को मिलाएं।
  5. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260 एनएम तरंगदैर्ध्य में एनजीएस पुस्तकालय की मात्रा निर्धारित करें और रीस्पेंशन बफर या 10 एलएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.5 का उपयोग करके 1 एनएम की एकाग्रता के लिए एनजीएस लाइब्रेरी को पतला करें। पुस्तकालय प्रकारों के आधार पर उचित लोडिंग एकाग्रता के लिए पतला पुस्तकालय के 100 माइक्रोन तैयार करें (उदाहरण के लिए, नेक्सेरा डीएनए फ्लेक्स के लिए पुस्तकालय का 200 पीएम तैयार करें)।
    1. एक नियंत्रण के रूप में, किट के प्रकार के लिए उपयुक्त पतला नमूना के साथ phiX गठबंधन।
    2. कारतूस पर पुस्तकालय लोड और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार NGS चलाते हैं। Illumina iSeq 100 या Miseq सिस्टम एकल पढ़ने या जोड़ा अंत के लिए 300 बीपी तक विभिन्न लंबाई के एम्प्लिकॉन अनुक्रम कर सकते हैं। हमने आधार संपादन दक्षता के गहन विश्लेषण के लिए प्रति लक्ष्य एम्प्लिकॉन 10,000 से अधिक पढ़ता है।

5. बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए आधार संपादन दक्षता का विश्लेषण

  1. मौंड24का उपयोग करके आधार संपादन क्षमता का विश्लेषण करें। आधार संपादन दक्षता की गणना नीचे वर्णित के रूप में की जाती है।
    Equation 1
    यदि BE3 सक्रिय विंडो में कई साइटोसाइन मौजूद हैं, तो केवल सी से टी रूपांतरण माना जाता है जिसे बीआरसीए1 संस्करण के मूल्यांकन के लिए लक्षित किया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि BE3 सक्रिय खिड़की के दृश्य "सी4ए5टी6सी7टी8" हैं,"आधार संपादन द्वारा उत्पन्न संभावित दृश्य "टी4ए5टी6सी 7टी8","सी4ए5टी6टी7टी8",और "टी4ए5टी6टी7टी8"। इस समय, यदि स्थिति 4 वांछित बीआरसीए1 संस्करण के लिए लक्षित स्थिति है, तो केवल आधार संपादन दक्षता की गणना के लिए "टी4ए5टी6सी 7टी8"अनुक्रम पर विचार किया जाता है।
    नोट: हम बेस एडिटिंग गतिविधि जैसे CRISPResso225,और बीई-एनालाइजर23के विश्लेषण के लिए अन्य वेब-टूल्स की भी सलाहते हैं।
  2. बीआरसीए1 वेरिएंट के सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग करके परिणामों को सत्यापित करें। सौम्य नियंत्रण की आधार संपादन क्षमता समान रहनी चाहिए, जबकि रोगजनक नियंत्रण के लोगों को समय के साथ कम होना चाहिए।
  3. बीआरसीए1 वेरिएंट की सापेक्ष आधार संपादन दक्षता की गणना करें और उनकी रोगजनकता का निर्धारण करें। दिन 0 और दिन 21 नमूनों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों को इस तरह के टीपरीक्षण के रूप में उचित सांख्यिकीय विश्लेषण का विश्लेषण कर रहे हैं ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रायोगिक दृष्टिकोण CRISPR-आधार साइटोसाइन बेस एडिटर द्वारा उत्पन्न अंतर्जात बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन को सक्षम करते हैं। बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त सेल लाइनों का चयन करने के लिए, शोधकर्ताओं को पुष्टि करनी चाहिए कि बीआरसीए1 लक्षित सेल लाइनों में आवश्यक जीन है । उदाहरण के लिए, हमने बीआरसीए1 को बाधित करने के लिए पहले Cas9 और gRNAs को HAP1 सेल लाइनों में स्थानांतरित किया और लक्षित गहरी अनुक्रमण द्वारा उत्परिवर्तन आवृत्तियों का विश्लेषण किया। हमने पाया कि HAP1 सेल लाइनों(चित्रा 4A)में समय के साथ उत्परिवर्तन आवृत्तियों में काफी कमी आई । इन परिणामों से पता चला है कि BRCA1 HAP1 सेल लाइनों में सेल व्यवहार्यता के लिए आवश्यक जीन है । यह जांचने के लिए कि क्या सी: जी से टी: एक प्रतिस्थापित वेरिएंट बीआरसीए1के कार्य को प्रभावित करते हैं, प्लाज्मिड डीएनए एन्कोडिंग जीआरएन, जो प्रत्येक उत्परिवर्तन को प्रेरित कर सकता है, HAP1-BE3 सेल लाइनों में संक्रमित थे और प्रतिस्थापन आवृत्तियों का विश्लेषण किया गया था। एक रोगजनक संस्करण सी.3598C>T (p Q1200*), एक रोगजनक संस्करण की सापेक्ष प्रतिस्थापन आवृत्तियों में नाटकीय रूप से कमी आई, जबकि सी.4527C>T (p.Y1509Y), एक सौम्य संस्करण, समय के साथ समान रहे(चित्रा 4B)। क्लिनव डाटाबेस में बीआरसीए1 के सी.154C>T (p L52F), c.3847C>T (p.H1283Y), और c.5056C>t (p.H1686Y) को अनिश्चित महत्व के वेरिएंट के रूप में सूचित किया गया है । हमने ऊपर उल्लिखित तरीकों का उपयोग करके इन वेरिएंट के कार्य का विश्लेषण किया और पाया कि इन तीनों वेरिएंट की न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन आवृत्तियों में समय पर निर्भर तरीके से कमी आई(चित्रा 4B)। इन परिणामों से, तीन प्रतिस्थापन BRCA1 समारोह बदल दिया है और रोगजनक उत्परिवर्तन के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है ।

Figure 4
चित्रा 4: CRISPR-Cas9 सिस्टम का उपयोग कर BRCA1 के कार्यात्मक अध्ययन के प्रतिनिधि परिणाम। (A)बीआरसीए1 व्यवधान कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित करता है । HAP1 कोशिकाओं को क्रमशः बीआरसीए1को लक्षित करने वाले प्लाज्मिड एन्कोडिंग spCas9 और दो gRNAs से संक्रमित किया गया था, और सेल व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए लक्षित गहरी अनुक्रमण किया गया था। बीआरसीए1 की उत्परिवर्तन आवृत्तियों में दो स्वतंत्र जीआरएएनए से संक्रमित कोशिकाओं में समय पर निर्भर तरीके से कमी आई, और सीसीआर 5 की उत्परिवर्तन आवृत्तियां, जिनका उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता था, समय के साथ समान रहे । (B)पांच बीआरसीए1 वेरिएंट का कार्यात्मक आकलन । HAP1-BE3 कोशिकाओं को क्रमशः बीआरसीए1 म्यूटेशन को उत्प्रेरण करने वाले GRNAs से संक्रमित किया गया था, और सेल व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए लक्षित गहरी अनुक्रमण किया गया था। सी.3598सी एंड जीटी,टी, सी.154सी एंड जीटी,टी, सी.3847सी एंड जीटी,टी और सी.5056सी एंड जीटी;टी और सी.4527सी एंड जीटी,टी की कोशिकाओं में एक समय पर निर्भर तरीके से सापेक्ष प्रतिस्थापन आवृत्तियों में कमी आई । त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि दिखाते हैं । तारांकन विभिन्न पी मूल्यों को दर्शाता है: * पी एंड एलटी;0.05; ** पी एंड लेफ्टिनेंट;0.005., एन.एस: महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल CRISPR-मनन साइटोसाइन बेस एडिटर का उपयोग करके बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल लक्ष्य लोकस पर जीआरएएनए के डिजाइन और प्लाज्मिड डीएनए के निर्माण के तरीकों का वर्णन करता है जिसमें से वे व्यक्त किए जाते हैं। साइटोसाइन बेस एडिटर एक सक्रिय विंडो में न्यूक्लियोटाइड रूपांतरण को प्रेरित करते हैं (बीई 3 के मामले में, जीआरएनए लक्ष्य दृश्यों के पाम-डिस्टल अंत में न्यूक्लियोटाइड 4-8)। शोधकर्ता को ध्यान से लक्ष्य दृश्यों का चयन करना चाहिए क्योंकि सक्रिय खिड़की में सभी साइटोसाइन को थाइमाइंस के प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, जैसा कि चरण 5 में वर्णित है, बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए एक सक्रिय खिड़की में कई साइटोसाइन का सावधानीपूर्वक विश्लेषण किया जाना चाहिए।

सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक लक्ष्य सेल लाइन में ट्रांसफैक्शन है, जो बीआरसीए1 कार्यात्मक आकलन के लिए प्रारंभिक उत्परिवर्तन आवृत्ति को प्रभावित करता है। प्रारंभिक उत्परिवर्तन आवृत्ति में सुधार करने के लिए, शोधकर्ताओं को ब्याज की सेल लाइन के लिए वितरण विधियों का अनुकूलन करना चाहिए । जैसा कि चरण 1 में वर्णित है, सेल लाइनों को व्यक्त करने वाली बीई 3 की पीढ़ी प्रारंभिक उत्परिवर्तन आवृत्ति को बढ़ाने के लिए उपयोगी विकल्प है। हम HAP1-BE3 कोशिकाओं में GRNA के लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन की सिफारिश नहीं करते हैं, क्योंकि BE3 और gRNA की संविलियन अभिव्यक्ति संचयी न्यूक्लियोटाइड रूपांतरण का कारण बन सकती है, और ये परिणाम बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन में हस्तक्षेप करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में पेश किए गए बीई 3 मध्यस्थताओं के अलावा, बीआरसीए1 वेरिएंट के कार्यात्मक आकलन को आगे बढ़ाने के लिए कई पूरक तरीकों की सिफारिश की जाती है। सबसे पहले, जैसा कि ऊपर वर्णित है, बीआरसीए1 वेरिएंट के आत्मविश्वासी परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक नमूने में उत्परिवर्तन आवृत्ति महत्वपूर्ण है। आधार संपादन दक्षता बढ़ाने के लिए, साइटोसाइन बेस एडिटर, जैसे BE4max के वेरिएंट की सिफारिश की जाती है। दूसरा, BE3 5'-NGG-3 ' पाम दृश्यों के माध्यम से लक्ष्य डीएनए अनुक्रम को पहचानता है, जो विभिन्न प्रकार के बीआरसीए1 वेरिएंट को उत्पन्न करने में एक सीमा है । हाल ही में विकसित सीए9 वेरिएंट परिवर्तित पाम दृश्यों के साथ इस मामले में उपयोगी विकल्प हैं ताकि लक्षित बीआरसीए1 वेरिएंट26, 27,28का विस्तार किया जा सके। तीसरा, बीई 3 अवांछित साइटों पर पर्याप्त आधार संपादन को प्रेरित करता है और ऑफ-टारगेट प्रभाव बीआरसीए1वेरिएंट29,30,31के कार्यात्मक मूल्यांकन को प्रभावित कर सकता है। BE3 के ऑफ-टारगेट प्रभाव को कम करने के लिए, जीआरएएनए की लक्षित साइटों को जीनोम में किसी भी समान दृश्यों के बिना सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए। सुरक्षित-BE3 या YE1, जो जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम में अवांछित आधार संपादन को कम करने के लिए विकसित किया गया है उपयोगी विकल्प३२,३३हैं । आगे, Cas9-मध्यस्थता एचडीआर पर आधारित एक संतृप्ति जीनोम संपादन (एसजीईई) विधि भी बीआरसीए1 वेरिएंट19के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए बढ़िया विकल्प है। इस विधि में बीआरसीए1 वेरिएंट के लक्ष्य दृश्यों और न्यूक्लियोटाइड पदों के चयन के लिए कोई सीमा नहीं है। हालांकि, एचडीआर-आधारित दृष्टिकोण आधार संपादकों की तुलना में अपेक्षाकृत कम कुशल है और इसके अतिरिक्त दाता टेम्पलेट्स14के डिजाइन और संश्लेषण की आवश्यकता होती है। अंत में, रोगी व्युत्पन्न बीआरसीए1 वेरिएंट में विभिन्न प्रकार के म्यूटेशन जैसे बिंदु उत्परिवर्तन, सम्मिलन और विलोपन शामिल हैं। इनमें से, बिंदु उत्परिवर्तन बीआरसीए1 वेरिएंट की प्रमुख आबादी हैं, जो न केवल सी: जी से टी: एक रूपांतरण हैं, बल्कि ए:टी से जी:सी, सी: जी से जी:सी, और ए:टी से टी: ए रूपांतरण भी हैं। इस प्रकार के रूपांतरणों के कार्यात्मक आकलन के लिए, CRISPR-मध्यस्थता एडेनोसाइन बेस एडिटर और प्राइम एडिटर मूल्यवान विकल्पहैं 34,35। तेजी से विकसित जीनोम इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों अधिक विविध BRCA1 वेरिएंट के कार्यात्मक आकलन में सक्षम हो जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (ग्रांट 2017M3A9B9B4062419, 2019R1F1A1057637, और 2018R1AA2020732 से वाईके) को सपोर्ट मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

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References

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