تصوير الكالسيوم في سلوك حر Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد
Summary
تم الإبلاغ هنا عن نظام لتصوير الكالسيوم في التصرف بحرية Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد. يسمح هذا النظام للباحثين باستحضار الاهتزازات غير الموضعية ذات الخصائص التي يتم التحكم فيها جيدا عند الإزاحة على نطاق النانو وتحديد تيارات الكالسيوم أثناء استجابات C. elegans للاهتزازات.
Abstract
تؤثر القوى الميكانيكية غير الموضعية ، مثل الاهتزازات والموجات الصوتية ، على مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية من التطور إلى التوازن. الحيوانات تتعامل مع هذه المحفزات عن طريق تعديل سلوكها. يتطلب فهم الآليات الكامنة وراء هذا التعديل السلوكي تحديد كمية النشاط العصبي أثناء سلوك الاهتمام. هنا ، نبلغ عن طريقة لتصوير الكالسيوم في التصرف بحرية Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي بتردد وإزاحة ومدة محددة. تسمح هذه الطريقة بإنتاج اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه جيدا باستخدام محول طاقة صوتي وتحديد كمية استجابات الكالسيوم المستحثة بدقة خلية واحدة. كدليل على المبدأ ، يتم إثبات استجابة الكالسيوم لخلية عصبية داخلية واحدة ، AVA ، أثناء استجابة هروب C. elegans للاهتزاز. سيسهل هذا النظام فهم الآليات العصبية الكامنة وراء الاستجابات السلوكية للمحفزات الميكانيكية.
Introduction
غالبا ما تتعرض الحيوانات لمحفزات ميكانيكية غير موضعية مثل الاهتزازات أو الموجات الصوتية 1,2. نظرا لأن هذه المحفزات تؤثر على التوازن والتنمية والتكاثر ، يجب على الحيوانات تعديل سلوكياتها للتعامل معها3،4،5. ومع ذلك ، فإن الدوائر العصبية والآليات الكامنة وراء هذا التعديل السلوكي غير مفهومة بشكل جيد.
السلوك الحسي الميكانيكي في الديدان الخيطية ، Caenorhabditis elegans ، هو نموذج سلوكي بسيط ، حيث عادة ما تغير الديدان السلوك من الحركة الأمامية إلى استجابة الهروب إلى الخلف عندما تواجه اهتزازا غير موضعي6. تتكون الدائرة العصبية الكامنة وراء هذا السلوك في المقام الأول من خمس خلايا عصبية حسية ، وأربعة أزواج من الخلايا العصبية الداخلية ، وعدة أنواع من الخلايا العصبية الحركية 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تعتاد الديدان على مثل هذه المحفزات الميكانيكية بعد التدريب المتباعد الذي ينطوي على التحفيز المتكرر9،10،11. لذلك ، تشكل هذه الاستجابة السلوكية البسيطة نظاما مثاليا للتحقيق في الآليات العصبية الكامنة وراء كل من السلوك والذاكرة غير الموضعية التي يستحدثها الاهتزاز. تم توضيح بروتوكول لتصوير الكالسيوم في الديدان التي تتصرف بحرية تحت تأثير الاهتزازات غير الموضعية. بالمقارنة مع الأنظمة التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، فإن هذا النظام بسيط من حيث أنه لا يتطلب كاميرا إضافية للتتبع ؛ ومع ذلك ، فإنه يسمح لنا بتغيير تردد وإزاحة ومدة الاهتزاز غير الموضعي. نظرا لأن تنشيط الخلايا العصبية الداخلية AVA يحفز استجابة الهروب إلى الوراء ، فقد تم استخدام الديدان التي تشارك في التعبير عن GCaMP ، وهو مؤشر الكالسيوم ، و TagRFP ، وهو بروتين فلوري غير حساس للكالسيوم ، تحت سيطرة مروج خاص ب AVA كمثال (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). يوضح البروتوكول تنشيط الخلايا العصبية AVA حيث تتحول الدودة من الحركة إلى الأمام إلى الخلف. يسهل هذا البروتوكول فهم آلية الدائرة العصبية الكامنة وراء السلوك الحسي الميكانيكي.
Protocol
Representative Results
Discussion
بشكل عام ، يتطلب التحديد الكمي للنشاط العصبي إدخال مسبار و / أو قيود على حركة جسم الحيوان. ومع ذلك ، بالنسبة لدراسات السلوك الحسي الميكانيكي ، فإن الإدخال الغازي للمسبار والقيود نفسها تشكل محفزات ميكانيكية. يوفر C. elegans نظاما للتحايل على هذه المشاكل ، لأن ميزاته شفافة ولأنه يحتوي على دا…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مركز Caenorhabditis Genetics Center على توفير السلالات المستخدمة في هذه الدراسة. تم دعم هذا المنشور من قبل JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant No. JP18H02483)، بشأن مشروع “علم الروبوت الناعم” في المجالات المبتكرة (رقم المنحة. JP18H05474)، وPRIME من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (رقم المنحة 19gm6110022h001)، ومؤسسة شيمادزو.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Autor | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
Referenzen
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetik. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
