Het doel van dit protocol is om de evolutie en expressie van kandidaatgenen te onderzoeken met behulp van RNA-sequencinggegevens.
Het distilleren en rapporteren van grote datasets, zoals hele genoom- of transcriptoomgegevens, is vaak een ontmoedigende taak. Een manier om resultaten op te splitsen is door je te concentreren op een of meer genfamilies die belangrijk zijn voor het organisme en de studie. In dit protocol schetsen we bioinformatische stappen om een fylogenie te genereren en de expressie van interessegenen te kwantificeren. Fylogenetische bomen kunnen inzicht geven in hoe genen zich ontwikkelen binnen en tussen soorten en orthologie onthullen. Deze resultaten kunnen worden verbeterd met behulp van RNA-seq-gegevens om de expressie van deze genen in verschillende individuen of weefsels te vergelijken. Studies van moleculaire evolutie en expressie kunnen modi van evolutie en behoud van genfunctie tussen soorten onthullen. De karakterisering van een genfamilie kan dienen als springplank voor toekomstige studies en kan een belangrijke genfamilie benadrukken in een nieuw genoom of transcriptoompapier.
Vooruitgang in sequencingtechnologieën heeft de sequencing van genomen en transcriptomen van niet-modelorganismen vergemakkelijkt. Naast de toegenomen haalbaarheid van het sequentiëren van DNA en RNA van veel organismen, is een overvloed aan gegevens openbaar beschikbaar om genen van belang te bestuderen. Het doel van dit protocol is om bio-informatische stappen te bieden om de moleculaire evolutie en expressie van genen te onderzoeken die een belangrijke rol kunnen spelen in het organisme van belang.
Het onderzoeken van de evolutie van een gen of genenfamilie kan inzicht geven in de evolutie van biologische systemen. Leden van een genfamilie worden meestal bepaald door het identificeren van geconserveerde motieven of homologe gensequenties. Genfamilie-evolutie werd eerder onderzocht met behulp van genomen van verre verwante modelorganismen1. Een beperking van deze benadering is dat het niet duidelijk is hoe deze genfamilies evolueren in nauw verwante soorten en de rol van verschillende selectieve omgevingsdruk. In dit protocol nemen we een zoektocht op naar homologen bij nauw verwante soorten. Door een fylogenie op fylumniveau te genereren, kunnen we trends in de evolutie van genfamilies opmerken, zoals die van geconserveerde genen of afstammingsspecifieke duplicaties. Op dit niveau kunnen we ook onderzoeken of genen orthesen of paralogen zijn. Hoewel veel homologen waarschijnlijk op dezelfde manier met elkaar functioneren, is dat niet noodzakelijk het geval2. Het opnemen van fylogenetische bomen in deze studies is belangrijk om op te lossen of deze homologe genen orthesen zijn of niet. Bij eukaryoten behouden veel ortheologen vergelijkbare functies in de cel, zoals blijkt uit het vermogen van zoogdiereiwitten om de functie van gistortheologen te herstellen3. Er zijn echter gevallen waarin een niet-orthologisch gen een gekarakteriseerde functie vervult4.
Fylogenetische bomen beginnen relaties tussen genen en soorten af te bakenen, maar de functie kan niet alleen worden toegewezen op basis van genetische relaties. Genexpressiestudies in combinatie met functionele annotaties en verrijkingsanalyse bieden een sterke ondersteuning voor de genfunctie. Gevallen waarin genexpressie kan worden gekwantificeerd en vergeleken tussen individuen of weefseltypen kunnen meer vertellen over de potentiële functie. Het volgende protocol volgt methoden die worden gebruikt bij het onderzoeken van opsinegenen in Hydra vulgaris7, maar ze kunnen worden toegepast op elke soort en elke genfamilie. De resultaten van dergelijke studies vormen een basis voor verder onderzoek naar genfunctie en gennetwerken in niet-modelorganismen. Het onderzoek naar de fylogenie van opsines, eiwitten die de fototransductiecascade initiëren, geeft bijvoorbeeld context aan de evolutie van ogen en lichtdetectie8,9,10,11. In dit geval kunnen niet-modelorganismen, met name basale diersoorten zoals cnidarianen of ctenoforen, de instandhouding of veranderingen in de fototransductiecascade en het gezichtsvermogen over de clades12,13,14verduidelijken . Evenzo zal het bepalen van de fylogenie, expressie en netwerken van andere genfamilies ons informeren over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan aanpassingen.
Het doel van dit protocol is om een overzicht te geven van de stappen voor het karakteriseren van een genfamilie met behulp van RNA-seq-gegevens. Het is bewezen dat deze methoden werken voor verschillende soorten en datasets4,34,35. De hier opgerichte pijplijn is vereenvoudigd en moet gemakkelijk genoeg zijn om te worden gevolgd door een beginner in bioinformatica. Het belang van het protocol is dat het alle stappen en noodzakel…
The authors have nothing to disclose.
We danken Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad en Aline G. Rangel voor advies en begeleiding bij het opnemen van enkele van deze stappen in onze workflow. We zijn ook Katherine Williams, Elisabeth Rebboah en Natasha Picciani dankbaar voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een George E. Hewitt Foundation for Medical research fellowship aan A.M.M.
Bioanalyzer-DNA kit | Agilent | 5067-4626 | wet lab materials |
Bioanalyzer-RNA kit | Agilent | 5067-1513 | wet lab materials |
BLAST+ v. 2.8.1 | On computer cluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
||
Blast2GO (on your PC) | On local computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic |
||
boost v. 1.57.0 | On computer cluster | ||
Bowtie v. 1.0.0 | On computer cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/ |
||
Computing cluster (highly recommended) | NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large. | ||
Cufflinks v. 2.2.1 | On computer cluster | ||
edgeR v. 3.26.8 (in R) | In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html |
||
gcc v. 6.4.0 | On computer cluster | ||
Java v. 11.0.2 | On computer cluster | ||
MEGA7 (on your PC) | On local computer https://www.megasoftware.net |
||
MEGAX v. 0.1 | On local computer https://www.megasoftware.net |
||
NucleoSpin RNA II kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | wet lab materials |
perl 5.30.3 | On computer cluster | ||
python | On computer cluster | ||
Qubit 2.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | wet lab materials |
R v.4.0.0 | On computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/ |
||
RNAlater | ThermoFisher | AM7021 | wet lab materials |
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | wet lab materials |
RSEM v. 1.3.0 | Computer software https://deweylab.github.io/RSEM/ |
||
RStudio v. 1.2.1335 | On local computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download |
||
Samtools v. 1.3 | Computer software | ||
SRA Toolkit v. 2.8.1 | On computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit |
||
STAR v. 2.6.0c | On computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR |
||
StringTie v. 1.3.4d | On computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ |
||
Transdecoder v. 5.5.0 | On computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases |
||
Trimmomatic v. 0.35 | On computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic |
||
Trinity v.2.8.5 | On computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases |
||
TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | wet lab materials |
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | wet lab materials |
TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | wet lab materials |
*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator. |