眼部微血管血管生成前维沃胆球状芽分析
Summary
该协议提供胆瘤发芽测定，微血管增殖的外体模型。这种测定可用于评估增殖胆小血管所涉及的途径，并评估使用野生型和转基因小鼠组织的药物治疗。
Abstract
病理胆瘤血管生成，年龄相关的黄斑变性的显著特征，导致视力障碍和失明。使用人类视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）或分离原发性视网膜EC进行内皮细胞增殖检测，在体外模型中广泛使用，用于研究视网膜血管生成。然而，分离纯杂音视网膜内皮细胞在技术上具有挑战性，视网膜ECs可能有不同的增殖反应比胆状内皮细胞和不同的细胞/细胞相互作用。开发了一种高度可重复的外体胆瘤发芽测定，作为胆球微血管增殖的模型。该模型包括胆道血管（EC、巨噬细胞、心状物）和视网膜色素上皮（RPE）之间的相互作用。小鼠RPE/胆状/细胞外植在生长因子减少基膜提取物（BME）（第0天）中分离和孵育。中等每隔一天改变一次，胆瘤发芽在第6天被量化。使用倒置相显微镜拍摄单个胆瘤外植的图像，并使用本实验室开发的 ImageJ 软件半自动宏插件对发芽区域进行量化。这种可重复的外体胆瘤发芽测定可用于评估化合物的潜在治疗和微血管疾病研究，以评估使用野生型和转基因小鼠组织参与胆小血管增殖的途径。
Introduction
胆血管生成失调与新血管年龄相关的黄斑变性（AMD）1。胆小球是视网膜色素上皮（RPE）下的微血管床。研究表明，胆瘤中血流量的减少与AMD2的进展有关。血管内皮、RPE、巨噬细胞、心肺和其他细胞之间的复杂关系是组织3、4、5的平衡。因此，可重复的测定建模对新血管AMD的研究至关重要。
前活体血管生成测定和体外内皮细胞培养可以补充对体内微血管行为的研究，用于测试新药和机制学研究。内皮细胞，如人类视网膜微血管内皮细胞（HRMEC），人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC），分离的原兽脑或视网膜ECs，常用于体外研究，用于眼血管生成研究6，7，8。特别是HRMEC已被广泛用作体外胆状新血管化（CNV）9的模型，通过评估内皮增殖、迁移、管状形成和血管渗漏来评估干预6、10。然而，由于在胆道中与其他细胞类型缺乏相互作用，并且由于这些测定中使用的大多数EC并非源自胆瘤，培养中的EC作为CNV的模型受到限制。在培养中，小鼠巧克力球状电子能难以分离和维护。
大动脉环测定被广泛用作大血管增殖的模型。来自大动脉外植的血管芽包括 ES、周食和巨噬细胞11。大音环测定模型大血管发生井12，13，14。然而，它作为胆囊新血管化的模型有局限性，因为大动脉环是缺乏特征的胆囊微血管环境的大血管组织，而来自大型血管的芽可能与涉及微血管病理学的毛细管网络的芽不同。最近，一个小组发表了一个前维维视网膜测定15，16。虽然，它适用于视网膜新血管疾病，但它不像在AMD中所看到的那样适合胆状新血管化。
利用小鼠RPE、胆球和胆碱外植组织进行胆瘤发芽测定，以更好地模拟CNV。组织可以很容易地从小鼠（或其他物种）的眼睛17分离。这种测定允许重复评估药理化合物的亲血管原位和抗血管原位，并评估特定途径在胆道新血管化中的作用，利用转基因小鼠和对控组18。这种胆瘤发芽测定已在许多后续出版物9，10，18，19，20被引用。在这里，演示了使用这种测定的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
胆瘤发芽分析辅助研究的新血管AMD9，10，18，19，20。胆龙外植可以从老鼠以及大鼠和人类17，21分离。胆道外植包括ECs，巨噬细胞，和心状体17。在此测定胆道DC与相邻细胞（如RPE细胞）之间的相互作用，有助于阐?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了曼佩铃木糖尿病基金会（YT）、波士顿儿童医院 OFD/BTREC/CTREC 教师职业发展补助金、波士顿儿童医院眼科基金会、BCH 试点奖、BCH 曼顿中心奖学金和小长颈鹿基金会 （ZF）、德国研究基金会 （DFG; 到 BC [CA1940/1-1]）， NIH R24EY024868， EY017017， R01717-13S1， EY030904-01， BCH IDDRC （1U54HD090255）， 马萨诸塞州狮子眼基金会 （LEHS）.
Materials
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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