3차원 공동배양시스템을 이용한 난소암 줄기유사세포의 혈관신생적 특성 평가 NICO-1
Summary
난소암 줄기세포(OCSC)는 암 시작, 재발, 치료 내성 및 전이를 담당합니다. OCSC 혈관 틈새는 OCSC의 자가 재생을 촉진하여 화학 내성을 유발하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 시험관 내에서 재현 가능한 OCSC 혈관 틈새 모델을 구축하기 위한 기초를 제공합니다.
Abstract
암 줄기 세포 (CSC)는지지 틈새 시장에 상주하여 인접한 기질 세포, 혈관 및 세포 외 기질로 구성된 미세 환경을 구성합니다. 내피 발달에 참여하는 CSC의 능력은 종양 발생 및 종양 전이의 메커니즘에 대한 일반적인 이해에 직접적으로 기여하는 중요한 특성을 구성합니다. 이 연구의 목적은 난소암 줄기세포(OCSC)의 종양 개시 능력을 조사하기 위한 재현 가능한 방법론을 확립하는 것입니다. 본 발명에서는 시험관 내 공동 배양 모델 NICO-1을 사용하여 내피 세포와 OCSC 사이의 신생혈관형성 메커니즘과 내피 세포의 형태학적 변화를 조사했습니다. 이 프로토콜은 OCSC를 둘러싼 신생 혈관 단계를 시간 경과 방식으로 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 종양 전이에서 OCSC의 혈관 신생 특성에 관한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
난소암은 전 세계적으로 여성에게 8번째로 흔한 악성 종양으로, 매년 약 300,000건의 새로운 진단과 약 180,000명의 사망이발생합니다1. 초기 진단에서 난소 암은 종종 심각한 증상을 나타내며 환자의 약 75 %가 이미 III-IV 기에 있습니다. 이에 따라 부인암2 중 5년 생존율이 <30%, 사망률이 가장 높으며, 난소암의 치료 효율은 용적폐 수술의 성공적 성취, 항암에 대한 내성, 초기 치료 후 재발 등의 임상적 요인에 크게 의존한다.
난소암 조직은 계층적으로 구성되어 있으며 모든 종양 구성 요소가 동등하게 자손을 생성할 수 있는 것은 아닙니다. 자가 재생하고 이질적인 종양 세포 집단을 생성할 수 있는 유일한 세포는 암 줄기 세포(CSC)를 나타내는 것으로 간주됩니다3. CSC 자가 재생 및 종양 개시는 지지적 틈새를 유지하기 위한 목적으로 종양 미세환경을 리모델링하기 위한 혈관신생의 촉진을 동반한다. 그러나 이전 모델은 다중 계대 배양 후 스페로이드의 파괴로 인해 임상 샘플에서 파생된 CSC 배양의 재현성이 제한적이기 때문에 시험관 내 분석에 활용할 수 없었습니다. 보다 최근에, 환자로부터 CSC를 배양하기 위한 실험적 방법이여러 응용 4,5,6,7을 위해 개발되었다. 특히, 배양된 줄기세포는 무혈청 배지로 초저 부착판에서 스페로이드를 형성하여 성장하는 CSC의 특성을 이용함으로써, 다계통 분화 가능성이 있는 정상 종양세포에서는 발현되지 않는 줄기세포 표면 마커를 발현하도록 유도한다(8,9).
최근 데이터에 따르면 복막에서 전파로 시각화 된 휴면 난소 (O) CSC의 지속성은 재발 성 종양10으로 재생되는 것과 관련이 있습니다. 따라서 OCSC의 분자 및 생물학적 특징을 이해하면 이러한 세포를 효과적으로 표적화하고 박멸하여 잠재적인 종양 완화를 초래할 수 있습니다. 특히, 혈관신생11에서 CSCs 역할의 세포 및 분자 기계론적 특징에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 따라서, 본 프로토콜에서는 임상 환경에서 전이 부위에서 CSC 및 내피 세포의 종양 미세 환경을 모방 할 수있는 공동 배양 모델을 사용하여 내피 세포의 혈관 신생 특성을 조사하기 위해 시험관 내 설정에서 환자 유래 OCSC를 사용했습니다. 궁극적으로 신생혈관형성은 종양 성장과 전이를 지원하는 데 필요한 중요한 과정을 구성하기 때문에 그 메커니즘을 더 잘 이해하면 전이 부위에서 OCSC에 대한 새로운 표적 요법을 개발할 수 있습니다.
여기에서는 CSC를 둘러싼 신생혈관화 단계를 시간 경과 방식으로 시각화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 장점은 3D 공동 배양 시스템인 NICO-1을 사용하여 완전히 재현 가능한 조사를 허용하여 내피 세포 혈관신생 동안 OCSC 유래 종양 개시 능력이 환자에 미치는 영향을 관찰할 수 있다는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 시험관 내 설정에서 OCSC의 종양 미세 환경을 모방하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 주요 구성 요소는 간접 Transwell 공동 배양 시스템인 NICO-1 시스템을 사용하여 얻은 재현성이 높은 공동 배양 모델을 구성합니다. 현재 이용 가능한 많은 공동 배양 모델은 공동 배양 된 세포 집단 12,13,14,15,16,17,18에 대한 직접적인 세포-세포 접촉의 효과를 조사합니다.<s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 일본 문부 과학문화부의 과학 연구 C 보조금(K.N.에 대한 보조금 번호 19K09834)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
Referenzen
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Krebsforschung. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Krebsforschung. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Krebsforschung. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
