Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe
Summary
Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.
Abstract
Der Erfolg der Implantation von im Labor gezüchtetem Gewebe oder eines medizinischen Geräts in eine Person hängt von der Immunantwort des Empfängerwirts ab. Betrachtet man ein Implantat als Fremdkörper, kann eine feindliche und dysregulierte Immunantwort zur Abstoßung des Implantats führen, während eine regulierte Reaktion und Wiedererlangung der Homöostase zu seiner Akzeptanz führen kann. Die Analyse der Mikroumgebungen von Implantaten, die unter In-vivo- oder Ex-vivo-Bedingungen präpariert werden, kann dazu beitragen, das Muster der Immunantwort zu verstehen, was letztendlich zur Entwicklung neuer Generationen von Biomaterialien beitragen kann. Die Durchflusszytometrie ist eine bekannte Technik zur Charakterisierung von Immunzellen und ihren Untergruppen anhand ihrer Zelloberflächenmarker. Diese Übersichtsarbeit beschreibt ein Protokoll, das auf manuellem Würfeln, enzymatischem Aufschluss und Filtration durch ein Zellsieb zur Isolierung einheitlicher Zellsuspensionen aus präpariertem Implantatgewebe basiert. Des Weiteren wurde ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Färbeprotokoll erläutert, zusammen mit Schritten für anfängliche Zytometereinstellungen, um diese isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie zu charakterisieren und zu quantifizieren.
Introduction
Fortschritte auf dem Gebiet der Medizin haben dazu geführt, dass häufig implantierte Materialien zur Unterstützung der Funktion oder des Nachwachsens von geschädigtem Gewebe verwendet werden 1,2. Dazu gehören Geräte wie Herzschrittmacher, rekonstruktive kosmetische Implantate und orthopädische Platten, die zur Fixierung von Knochenbrüchen verwendet werden 3,4. Die Materialien, die zur Herstellung dieser Implantate verwendet werden, und die Stellen, an denen sie implantiert werden, spielen jedoch eine wichtige Rolle für den Erfolg dieser Implantate 5,6,7. Als Fremdkörper können diese Implantate eine Immunantwort des Wirts hervorrufen, die entweder zu einer Abstoßung oder zu einer Toleranz führen kann8. Dieser Faktor hat die Biomaterialforschung vorangetrieben, um Materialien zu entwickeln, die nach der Implantation die gewünschte Immunantwort hervorrufenkönnen 9,10,11,12.
Die Immunantwort ist eine wesentliche Voraussetzung im Bereich der regenerativen Medizin, bei der ein Gewebe oder ein Organ in einem Labor um ein Biomaterialskelett (Gerüst) herum gezüchtet wird, um ein beschädigtes Gewebe oder Organ zu ersetzen13,14,15,16. In der regenerativen Medizin besteht das Ziel darin, fehlendes oder beschädigtes Gewebe durch den Einsatz von Zellen, Signalen und Gerüsten zu ersetzen, von denen jedes durch Immunantworten stark moduliert werden kann17. Selbst wenn eine fehlende Immunantwort erwünscht ist, ist es sehr selten eine Abwesenheit von Immunaktivität und nicht das Vorhandensein eines regulatorischen Profils, das erwünscht ist18. Techniken wie die Durchflusszytometrie können eine wichtige Rolle bei der Charakterisierung des Musters der Immunantwort auf verschiedene Biomaterialien spielen, die für die Beschichtung von Implantaten oder für die Entwicklung von Gerüsten für das Tissue Engineering verwendet werden19.
Diese Informationen wiederum werden letztendlich dazu beitragen, Biomaterialien für Implantate zu entwickeln, die vom Immunsystem gut vertragen werden können, oder Gerüste zu entwickeln, die eine konstruktive Rolle beim Tissue Engineering spielen können. Die richtige Vorbereitung der Proben für die Analyse mittels Durchflusszytometrie ist ein wichtiger Schritt, um ungenaue Ergebnisse bei der Immuncharakterisierung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu vermeiden20,21. Daher wird in dieser Übersichtsarbeit eine detaillierte Methodik vorgestellt, die für die Isolierung von Zellen aus Gerüstgewebe, die Färbung der Zellsuspension und die Analyse mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Übersichtsarbeit beschreibt eine detaillierte Methodik zur Isolierung von Zellen aus Biomaterialimplantaten, um eine einheitliche Zellsuspension zu erhalten. Darüber hinaus wurde ein detailliertes Protokoll für die Färbung der Zellsuspension für die Mehrfarben-Durchflusszytometrie sowie die Schritte zur Konfiguration eines Durchflusszytometers für optimale Ergebnisse bereitgestellt. Zellisolierungsmethoden können mehrere Schritte umfassen, wobei häufig eine manuelle Gewebedissektion gefolgt von einem enzyma…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde teilweise durch das Intramurale Forschungsprogramm der NIH unterstützt, einschließlich des National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Haftungsausschluss: Die NIH, ihre leitenden Angestellten und Mitarbeiter empfehlen oder befürworten keine Unternehmen, Produkte oder Dienstleistungen.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
Referenzen
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