تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام إليجانات Caenorhabditis
Summary
يمكن استخدام النيماتودا Caenorhabditis elegans القابلة للسحب وراثيا كنموذج بسيط وغير مكلف لاكتشاف الأدوية. وصف هنا هو بروتوكول لتحديد العلاجات المضادة للانسان التي تمنع الإشارات المصب من RAS وEGFR البروتينات.
Abstract
وقد تورطت التغيرات في توطين غشاء البلازما لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) وتأثيرها المصب RAS في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان. النيماتودا C. elegans العيش الحر تمتلك التطورية والمحافظ عليها وظيفيا EGFR-RAS-ERK MAP سلسلة إشارة التي هي مركزية لتطوير الفرج. كسب الطفرات وظيفة في RAS homolog LET-60 وEGFR homolog LET-23 حث توليد pseudovulva خارج الرحم مرئية على طول جدار الجسم البطني من هذه الديدان. في السابق ، كان النمط الظاهري متعدد الصمامات (Muv) في هذه الديدان مثبطا بجزيئات كيميائية صغيرة. هنا نصف بروتوكول لاستخدام الدودة في المقايسة القائمة على السائل لتحديد مثبطات إلغاء أنشطة EGFR و RAS البروتينات. باستخدام هذا المقايسة، نعرض R-fendiline، مثبط غير مباشر من K-RAS، يقمع النمط الظاهري Muv المعبر عنه في let-60 (n1046) والسماح-23(sa62) الديدان المتحولة. المقايسة بسيطة وغير مكلفة ، ليست مضيعة للوقت لإعداد ، ويمكن استخدامها كمنصة أولية لاكتشاف العلاجات المضادة للانسان.
Introduction
يتم الحفاظ على المسارات الخلوية التي تنظم الأحداث التنموية داخل الكائنات الحية بشكل كبير بين جميع الميتازوان. أحد هذه المسارات هو EGFR-RAS-ERK mitogen تنشيط البروتين كيناز (MAPK) سلسلة الإشارات التي هي مسار حاسم الذي يحكم انتشار الخلايا, التمايز, الهجرة والبقاء على قيد الحياة1,2. يمكن أن تؤدي العيوب في مسار الإشارات هذا إلى حالات مرضية أو مرضية مثل السرطان. وقد أظهرت مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) أن أعرب عنها بشكل كبير في الأورام البشرية، بما في ذلك 50٪ من سرطان الخلايا الحرشفية عن طريق الفم، ويساهم في تطوير الأورام الخبيثة3،4،5. في حين أن الطفرات في ثلاثة RAS isoforms H-, K- و N-RAS هي المحركات الرئيسية للتحول الخبيث في سرطانات بشرية متعددة. من بين هذه ISOFORMs RAS الثلاثة، الطفرات أونكوجينيك في K-RAS هي الأكثر انتشارا6،7،8. لكي تعمل EGFR وRAS ، يجب أن يتم توطينها في غشاء البلازما (PM). منع توطين هذه الجزيئات إلى رئيس الوزراء يمكن أن يلغي تماما النشاط البيولوجي لهذا المسارإشارة 9،10. ومن هنا فإن تثبيط توطين هذه البروتينات لرئيس الوزراء هو استراتيجية علاجية لمنع الإشارات المصب والنتائج السلبية الناتجة. باستخدام فحص عالي المحتوى ، تم تحديد fendiline ، وهو مانع قناة الكالسيوم من نوع L ، كمثبط لنشاط K-RAS11. يتم تقليل Nanoclustering من K – RAS إلى المنشور الداخلي لرئيس الوزراء بشكل كبير في وجود fendiline. وعلاوة على ذلك، يتم إعادة توزيع K-RAS من غشاء البلازما إلى الشبكية الانتوبلازمية (ER)، جهاز غولجي، الاندوسومات، والسيتوسول. الأهم من ذلك، يتم حظر انتشار البنكرياس والقولون والرئة، وخطوط الخلايا السرطانية بطانة الرحم التعبير عن متحولة oncogenic K-RAS عن طريق تثبيط الإشارات المصب من قبل fendiline11. تشير هذه البيانات وظائف fendiline كعلاج محدد K-RAS المضادة للانسان الذي يسبب سوء توطين بروتين RAS إلى رئيس الوزراء.
وقد درست على نطاق واسع في nematode Caenorhabditis elegans في سياق التنمية. العديد من مسارات الإشارات التي تحكم التنمية في الدودة هي التطورية والحفاظ عليها وظيفيا. على سبيل المثال، تم التوسط في EGFR تنشيط RAS والتنشيط اللاحق لسلسلة إشارة ERK MAPK يتم حفظها في الفيروس المتنقل12. يتم تمثيل السلسلة البروتينات التالية: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 هو متجانسة لRAS، في حين LET-23 هو متجانسة لEGFR. في الدودة ، ينظم هذا المسار تطور الفرج13. الفرج هو فتحة الظهارية على جدار الجسم البطني من الدودة التي تسمح للبويضات المخصبة لوضعها. يعتمد تكوين الفرج في الدودة على تعرض خلايا السلائف الفرجية (VPC) لتدرج تنشيط سلسلة إشارة EGFR-RAS-MAPK. خلال التطور الطبيعي ، تتلقى VPCs القريبة إشارات قوية من خلايا ارتساء الغدد التناسلية للتمييز إلى مصائر خلايا 1° و 2 ° التي تؤدي إلى فرج وظيفي12. في حين أن VPCs البعيدة تفرق إلى مصائر الخلايا 3 ° التي تنصهر إلى التزامن hypodermal ولا تشكل الفرج بسبب الإشارات المستنفدة. في حالة عدم وجود إشارات ، تفرق جميع VPCs إلى مصائر خلايا 3 ° مما يؤدي إلى تكوين أي فرج. ومع ذلك ، تؤدي الإشارات التأسيسية إلى تشكيل فرج واحد أو أكثر غير وظيفي بسبب تحريض جميع VPCs على افتراض مصائر الخلية 1° و 2° .
تم تحديد الطفرات التي تسبب الحث الفرجي المعيب أو المفرط للعديد من الجينات التي ترمز إلى البروتينات التي تمثل هذا المسار. يؤدي التعريفي الفرجي المعيب إلى النمط الظاهري الفرجي (Vul) ، في حين يؤدي التعريفي الفرجي المفرط إلى النمط الظاهري متعدد الأصوات (Muv) الذي يمثله تطور العديد من السودوفولفا المنتبذة غير الوظيفة في جميع أنحاء جدار الجسم البطني. النمط الظاهري Muv التي أعرب عنها let-60(n1046) سلالة يرجع إلى زيادة طفرة وظيفة في RAS, بينما في سلالة السماح-23 (sa62) ومن المقرر طفرة تنشيط في EGFR14,15. وقد ثبت أن النمط الظاهري Muv قوية في هذه السلالات متحولة أن تكون مضطربة من التدخلات الدوائية كما يتضح من خلال علاج الديدان السماح-60 (n1046) مع مثبط MEK-1 U012616,17. ومن المثير للاهتمام, لقد أظهرنا أن R-fendiline ومثبطات التي تؤثر على التمثيل الغذائي sphingomyelin قمع النمط الظاهري موف في دودة18. لإثبات هذه المثبطات كتلة السماح-60 الإشارات على مستوى RAS، وقد استخدمت سلالة خالية لين-1 17. Lin-1 هو عامل نسخ مثبط يشبه Ets يعمل كمقمع في تطور الفرج19. إعادة قوية من النمط الظاهري Muv في السماح-60 (n1046) الديدان وليس لها تأثير على لين-1 الديدان الخالية تشير إلى أن هذه الموانع تحدث على مستوى RAS.
في هذا البروتوكول، ونحن نظهر استخدام C. elegans كنموذج لتحديد مثبطات RAS وEGFR البروتينات. باستخدام المقايسة القائمة على السائل، ونحن نظهر الآثار المثبطة للR-fendiline عن طريق قمع الأنماط الظاهرية Muv في let-60 (n1046) واسمحوا-23(sa62) سلالات متحولة من C. elegans. هذا المقايسة يؤكد استخدام C. elegans كأداة في المرحلة الأولى من اكتشاف المخدرات لعلاجات مضادة للانسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن المقايسات التي نصفها باستخدام الدودة بسيطة وغير مكلفة لتحديد مثبطات وظيفة EGFR و RAS. C. elegans هو نموذج جذاب لاكتشاف المخدرات لأنه من السهل أن تنمو في المختبر بسبب دورة الحياة القصيرة (3 أيام عند 20 درجة مئوية) والقدرة على توليد أعداد كبيرة من اليرقات. والأهم من ذلك، يتم الحفاظ على مسار EGFR-RA…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور Swathi أرور (MD أندرسون مركز السرطان) لتوفير السماح-60 (n1046). كما نشكر الدكتور ديفيد راينر (معهد مركز تكساس للعلوم الصحية للعلوم الحيوية والتكنولوجيا في هيوستن) على سلالة لين-1. وأخيرا، نشكر الدكتورة دانييل غارسين ومختبرها (جامعة تكساس، كلية ماكغفرن الطبية) على توفير بعض الكواشف. تم توفير بعض سلالات الديدان من قبل CGC ، التي يمولها مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). تم دعم هذا البحث من قبل معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (CPRIT) منحة RP200047 إلى JF هانكوك.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Referenzen
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Krebsforschung. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Krebsforschung. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Krebsforschung. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetik. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
