Reinigung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen und Isotypen aus begrenzten Quellen durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Tubulinreinigung aus kleinen/mittleren Quellen wie kultivierten Zellen oder Gehirnen mit einer Maus unter Verwendung von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen. Das gereinigte Tubulin ist in bestimmten Isotypen angereichert oder hat spezifische posttranslationale Modifikationen und kann in In-vitro-Rekonstitutions-Assays zur Untersuchung der Mikrotubuli-Dynamik und -Wechselwirkungen verwendet werden.

Abstract

Ein wichtiger Aspekt der Untersuchungen des Mikrotubuli-Zytoskeletts ist die Untersuchung des Mikrotubuli-Verhaltens in In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten. Sie ermöglichen die Analyse der intrinsischen Eigenschaften von Mikrotubuli, wie dynamik, und ihrer Wechselwirkungen mit mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs). Der “Tubulin-Code” ist ein neu entstehendes Konzept, das auf verschiedene Tubulin-Isotypen und verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) als Regulatoren von Mikrotubuli-Eigenschaften und -Funktionen verweist. Um die molekularen Mechanismen des Tubulin-Codes zu erforschen, ist es entscheidend, In-vitro-Rekonstitutionsexperimente mit gereinigtem Tubulin mit spezifischen Isotypen und PTMs durchzuführen.

Bis heute war dies technisch eine Herausforderung als Gehirn Tubulin, das weit verbreitet in In-vitro-Experimente verwendet wird, beherbergt viele PTMs und hat eine definierte Isotypzusammensetzung. Daher haben wir dieses Protokoll entwickelt, um Tubulin aus verschiedenen Quellen und mit unterschiedlichen Isotypzusammensetzungen und kontrollierten PTMs zu reinigen, wobei der klassische Ansatz von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen verwendet wird. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die auf der Affinitätsreinigung basieren, ergibt dieser Ansatz reines, polymerisationskompetentes Tubulin, da Tubulin, das gegen Polymerisation oder Depolymerisation resistent ist, während der aufeinanderfolgenden Reinigungsschritte verworfen wird.

Wir beschreiben die Reinigung von Tubulin aus Zelllinien, die entweder in Suspension oder als anhantibe Kulturen angebaut werden, und von einzelnen Mausgehirnen. Das Verfahren beschreibt zunächst die Erzeugung von Zellmasse sowohl in Suspensions- als auch in Hafteinstellungen, dem Lyseschritt, gefolgt von den aufeinanderfolgenden Stadien der Tubulinreinigung durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen. Unsere Methode liefert Tubulin, das in Experimenten verwendet werden kann, die sich mit dem Einfluss des Tubulin-Codes auf die intrinsischen Eigenschaften von Mikrotubuli und Mikrotubuli-Wechselwirkungen mit assoziierten Proteinen befassen.

Introduction

Mikrotubuli spielen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle. Sie geben Zellen ihre Form, bauen meiotische und mitotische Spindeln für die Chromosomensegregation und dienen als Spuren für den intrazellulären Transport. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, organisieren sich Mikrotubuli auf unterschiedliche Weise. Eine der faszinierendsten Fragen auf diesem Gebiet ist es, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die es den strukturell und evolutionär konservierten Mikrotubuli ermöglichen, sich an diese Fülle von Organisationen und Funktionen anzupassen. Ein potenzieller Mechanismus ist die Diversifizierung der Mikrotubuli, die durch das Konzept definiert wird, das als “Tubulin-Code”^1,2,3” bekannt ist. Der Tubulin-Code umfasst zwei Hauptkomponenten: die Differentialintegration von α- und β-Tubulin-Genprodukten (Tubulin-Isotypen) in die Mikrotubuli und Tubulin-Posttranslationalmodifikationen (PTMs).

Seit den 1970er Jahren haben In-vitro-Rekonstitutionsexperimente, kombiniert mit sich entwickelnden Lichtmikroskopie-Techniken, den Weg für wichtige Entdeckungen über die Eigenschaften von Mikrotubuli geebnet: dynamische Instabilität⁴ und Laufband^5,und ihre anderen Mechanismen und Funktionen^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Fast alle bisher durchgeführten In-vitro-Experimente basierten auf Tubulin, das aus Hirngewebe mit wiederholten Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation^16,17gereinigt wurde. Obwohl die Reinigung aus dem Hirngewebe den Vorteil der Gewinnung von hochwertigem Tubulin in großen Mengen (in der Regel Grammmengen) verleiht, ist ein wichtiger Nachteil die Heterogenität, da Tubulin, das aus Hirngewebe gereinigt wird, eine Mischung aus verschiedenen Tubulin-Isotypen ist und mit vielen Tubulin-PTMs angereichert ist. Diese Heterogenität macht es unmöglich, die Rolle eines bestimmten Tubulin-PTM oder Isotyps bei der Kontrolle von Mikrotubuli-Eigenschaften und -Funktionen abzustecken. Daher ist die Herstellung von Montage-kompetentem Tubulin mit kontrollierten Tubulin-PTMs und homogener Isotypzusammensetzung unerlässlich, um die molekularen Mechanismen des Tubulincodes anzugehen.

Kürzlich wurde ein Ansatz zur Reinigung von Tubulin durch Affinitätschromatographie mit der mikrotubulienbindenden TOG-Domäne (Tumor-überexprimiertes Gen) der Hefe Stu2p^entwickelt. Bei dieser Methode wird Tubulin in rohen Lysaten von Zellen oder Geweben durch eine Säule geleitet, wo es an die matriximmobilisierte TOG-Domäne bindet, die die Analyse des gesamten Tubulinpools einer bestimmten, sogar sehr kleinen Probe ermöglicht. Ein lang erwarteter Ansatz zur Reinigung des rekombinanten Tubulins wurde in den letzten Jahren ebenfalls beschrieben. Es basiert auf dem Baculovirus-System, in dem ein bi-cistronischer Vektor, der α- und β-Tubulin-Gene enthält, in Insektenzellen¹⁹exprimiert wird. Diese Methode ist jedoch sehr umständlich und zeitaufwändig und wird daher hauptsächlich zur Untersuchung der Auswirkungen der Tubulinmutationen²⁰ und der Tubulin-Isotypen^21,22,23 in vitro verwendet.

Im aktuellen Protokoll beschreiben wir eine Methode, die den etablierten und weit verbreiteten Polymerisations-Depolymerisationsansatz als Blaupause verwendet, um Tubulin mit unterschiedlichen Modifikationsstufen entweder aus Zelllinien oder aus Maushirngewebe zu erzeugen²⁴. Bei diesem Verfahren wird Tubulin zwischen dem löslichen (Tubulin-Dimer bei 4 °C) und der polymerisierten Form (Mikrotubuli bei 30 °C in Gegenwart von Guanosin 5′-Triphosphat [GTP]) geradelt. Jede Form wird durch aufeinander folgende Zentrifugationsschritte getrennt: Tubulin-Dimere bleiben nach einer Erkältung (4 °C) im Überstand, während Mikrotubuli bei 30 °C pelletiert werden. Darüber hinaus wird ein Polymerisationsschritt bei hoherPiperazin-N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES) Konzentration durchgeführt, die die Entfernung von mikrotubuli-assoziierten Proteinen aus den Mikrotubuli und damit aus dem schließlich gereinigten Tubuli ermöglicht. Tubulin gereinigt aus HeLa S3 Zellen als Suspension oder anhantibe Kulturen gewachsen ist praktisch frei von jedem Tubulin PTM und wurde in den jüngsten In-vitro-Rekonstitutionsexperimente^25,26,27,28verwendet. Wir haben die Methode zur Reinigung von Tubulin von einzelnen Mausgehirnen weiter angepasst, die für eine große Anzahl von Mausmodellen mit Änderungen in Tubulin-Isotypen und PTMs verwendet werden können.

Im Protokoll beschreiben wir zunächst die Erzeugung des Ausgangsmaterials (Zellmasse oder Hirngewebe), seine Lyse (Abbildung 1A), gefolgt von den aufeinanderfolgenden Schritten der Tubulinpolymerisation und Depolymerisation zur Reinigung des Tubulins (Abbildung 1B). Wir beschreiben ferner das Verfahren zur Beurteilung der Reinheit (Abbildung 2A,B) und der Menge (Abbildung 3A,B) des gereinigten Tubulins. Das Verfahren kann angepasst werden, um Tubulin zu produzieren, das mit einem ausgewählten PTM angereichert ist, indem ein modifizierendes Enzym in Zellen vor der Tubulinreinigung überexzessiert wird (Abbildung 4B). Alternativ können Tubulin-modifizierende Enzyme während des Reinigungsprozesses dem Tubulizuz hinzugefügt werden. Schließlich können wir Tubulin ohne spezifische Isotypen oder PTMs aus dem Gehirn von Mäusen reinigen, die einen Mangel an den entsprechenden Tubulin-modifizierenden Enzymen aufweisen (Abbildung 4B)²⁹.

Die Methode, die wir hier beschreiben, hat zwei Hauptvorteile: (i) es ermöglicht die Produktion ausreichend großer Mengen Tubulin in relativ kurzer Zeit, und (ii) es erzeugt hochwertiges, reines Tubulin, entweder mit spezifischer Tubulin-Isotypzusammensetzung oder PTMs. Im zugehörigen Video dieses Manuskripts heben wir einige der kritischen Schritte dieses Verfahrens hervor.

Protocol

Die Tierpflege und -verwendung für diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/UE) durchgeführt. Experimentelle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Institut Curie CEEA-IC #118 (Genehmigungnr. 04395.03 von der nationalen Behörde) in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien ausdrücklich genehmigt. 1. Herstellung von Reagenzien zur Tubulinreinigung HINWEIS: Alle Puffer, die für die Tubulinr…

Representative Results

Das Hauptziel dieser Methode ist die Herstellung von hochwertigem, montagekompetentem Tubulin in Mengen, die für wiederholte In-vitro-Experimente mit den gereinigten Komponenten ausreichen. Aus diesem Tubulin zusammengesetzte Mikrotubuli können in Rekonstitutionstests verwendet werden, die auf der gesamten internen Reflexionsfluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) mit dynamischen oder stabilen Mikrotubuli basieren, in Experimenten, die Mikrotubulidynamik, Wechselwirkungen mit MAPs oder molekularen Motoren und die Krafterzeugung…

Discussion

Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform, um schnell hochwertiges, montagekompetentes Tubulin in mittelgroßen Mengen aus Zelllinien und einzelnen Mausgehirnen zu erzeugen. Es basiert auf dem Gold-Standard-Protokoll der Tubulinreinigung von Rinderhirnen, die seit vielen Jahren im Feld verwendet werden^16,17. Ein besonderer Vorteil des Ansatzes ist die Verwendung von Suspensionskulturen von HeLa S3-Zellen, die, sobald sie etabliert sind, große Mengen an…

Materials

1 M MgCl2	Sigma	#M1028
1-L cell culture vessels	Techne F7610		Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol	Sigma	#M3148	2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride	Sigma	#A8456
40% Acrylamide	Bio-Rad	#161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)	Sigma	#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10	Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa		dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	dilution: 1/20,000
Aprotinin	Sigma	#A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles			For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge			For collecting spinner cultures
Biological stirrer	Techne MCS-104L		Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide	Bio-Rad	#161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®			For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
Bromophenol blue	Sigma	#1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium	Life Technologies	#41965062
DTT, DL-Dithiothreitol	Sigma	#D9779
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma	#E3889
Ethanol absolute	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F7524
French pressure cell press	Thermo electron corporation	#FA-078A	with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol	VWR Chemicals	#24388.295
Glycine	Sigma	#G8898
GTP	Sigma	#G8877
Heating block	Stuart	#SBH130D
Hela cells		ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells	ATCC	ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )	VWR	#20252.290
Inverted microscope			With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
JLA-8.1000 rotor			For collecting spinner cultures
KOH	Sigma	#P1767	KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine	Life Technologies	#25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes	Sigma	4-16 K
Leupeptin	Sigma	#L2884
Liquid nitrogen
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles	Eppendorf	#0030 120.973
Mouse brain tissue			Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm	Terumo	#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm	Terumo	#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Life Technologies	#14190169
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	#P7626	PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES	Sigma	#P6757
Pipette-boy
Rotors	Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment	Bio-Rad	#1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate	VWR	#442444H	For preparing Laemmeli buffer
SDS, Sodium dodecyl sulphate	Sigma	#L5750	For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator	Branson	#101-148-070	Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma	#9281
Trichostatin A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma	#T9284
Trizma base (Tris)	Sigma	#T1503
Trypsin	Life Technologies	#15090046
Ultracentrifuge rotors		TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#357448	for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#349622	for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#355631	for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges	Beckman	Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders			Set at 30°C