PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Summary

Dieser Artikel stellt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Methoden zur Expression und Reinigung von Salmonella typhimurium tryptophan synthase vor, die dieses Protokoll zu einem schnellen System zur Reinigung des Proteinkomplexes an einem Tag machen. Abgedeckte Methoden sind ortsgerichtete Mutagenese, Proteinexpression in Escherichia coli,Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisation.

Abstract

Strukturstudien mit Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α₂β₂ TS) aus Salmonella typhimurium wurden durchgeführt, um seinen katalytischen Mechanismus, sein allosterisches Verhalten und Details der enzymatischen Umwandlung von Substrat in Ein produkt in PLP-abhängigen Enzymen besser zu verstehen. In dieser Arbeit ermöglichte ein neuartiges Expressionssystem zur Herstellung der isolierten α- und isolierten β-Untereinheit die Reinigung hoher Mengen reiner Untereinheiten und α₂β₂StTS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten innerhalb von 2 Tagen. Die Reinigung erfolgte durch Affinitätschromatographie, gefolgt von Spaltung des Affinitäts-Tags, Ammoniumsulfat-Fällung und Größenausschlusschromatographie (SEC). Um die Rolle von Schlüsselrückständen am Enzym β besser zu verstehen, wurde in früheren Strukturstudien eine ortsseitige Mutagenese durchgeführt. Ein weiteres Protokoll wurde erstellt, um den Wildtyp und die Mutanten α₂β₂StTS-Komplexen zu reinigen. Ein einfaches, schnelles und effizientes Protokoll mit Ammoniumsulfatfraktionierung und SEC ermöglichte die Reinigung von α₂β 2StTS-Komplexes an_einemeinzigen Tag. Beide in dieser Arbeit beschriebenen Reinigungsprotokolle haben erhebliche Vorteile im Vergleich zu früheren Protokollen zur Reinigung desselben Komplexes mit PEG 8000 und Spermin, um den α₂β₂StTS-Komplex entlang des Reinigungsprotokolls zu kristallisieren. Die Kristallisation von Wildtyp- und einigen Mutiertenformen erfolgt unter leicht unterschiedlichen Bedingungen, was die Reinigung einiger Mutanten mit PEG 8000 und Spermin beeinträchtigt. Um Kristalle vorzubereiten, die für röntgenkristallographische Untersuchungen geeignet sind, wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um Kristallisation, Kristallqualität und Kryoprotektion zuoptimieren. Die hier vorgestellten Methoden sollten allgemein zur Reinigung von Tryptophansynthase-Untereinheiten und Wildtyp- und Mutanten-α₂β₂StTS-Komplexen anwendbar sein.

Introduction

Der Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α₂β₂₎ist ein allosterisches Enzym, das die letzten beiden Schritte in der Biosynthese der Aminosäure L-Tryptophan in Bakterien, Pflanzen und Pilzen katalysiert^1,2,3. Das Bakterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) verursacht eine schwere Magen-Darm-Infektion bei Menschen und anderen Tieren. Da Menschen und höhere Tiere kein TS (EC 4.2.1.20) haben, wurde die Hemmung von S. typhimurium α₂β₂ TS-Komplex (α₂β₂StTS) als potenzielles Wirkstoffziel für die Behandlung von Kryptosporidiose und Tuberkulose⁴, Genital- und Augeninfektionen⁵und für den möglichen Herbizideinsatz in der Landwirtschaft⁶untersucht. Die α-Untereinheit katalysiert die aldolytische Spaltung von Indol-3-Glycerinphosphat (IGP) zu Glyceraldehyd-3-phosphat (GAP) und Indol, durch die Bildung eines Indolenin-Tautomer-Zwischen- und anschließenden Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsspaltungsspaltung zur Herstellung von GAP und Indol^3,6. Die β-katalytische Stelle enthält ein pyridoxalen 5′-Phosphat (PLP)-Cofaktormolekül, das über eine Schiff-Base an β-Lys87 gebunden ist, das im Verlauf der Reaktionen am Enzym β-Untereinheit^3,7als Elektronensenke fungiert. Die β-Stelle katalysiert den Ersatz des L-Serin-Seitenkettenhydroxyls durch Indol, um L-Tryptophan und ein Wassermolekül in einer PLP-abhängigen Reaktion zu erhalten. St. TS dient als langjähriges Modell zur Untersuchung der Substratkanalisierung und allosterischen Kommunikation innerhalb von Multienzymkomplexen^2,3. Die bidirektionale allosterische Kommunikation zwischen den α- und β-Untereinheiten von TS ist notwendig, um die katalytischen Schritte zu synchronisieren und die Indolfreisetzung während der L-Tryptophan-Synthese zu verhindern³. Um diese Bemühungen zu erweitern, haben wir mehrere Mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr und β-Ser377Ala) durch Einzelpunktmutation vorbereitet, die bei weiteren Untersuchungen der Beziehung zwischen Enzymstruktur, Mechanismus und Funktion an der katalytischen Stelle der St.TS-β-Untereinheit verwendet werden sollen.

Detaillierte Forschungen zum katalytischen Mechanismus von α₂β₂StTS wurden von der Forschungsgruppe von Edith W. Miles initiiert. Frühe Studien mit nativen Escherichia coli α₂β₂ TS-Komplex konzentrierten sich auf die Reinigung und Charakterisierung der isolierten α-Untereinheit^8,9, isolierten β-Untereinheit^10,11 und die Rekonstitution des α₂β₂ TS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten¹². Die Reinigung erfolgte durch Ammoniumsulfatfällung, Probendialyse, DEAE-Sephadex-Chromatographie, Dialyse und eine zweite chromatographische Runde auf einer DEAE-Sephadex-Säule^12. In einem anderen Protokoll wurde die Reinigung desselben Komplexes verbessert, indem das geklärte Zelllysat auf eine DEAE-Sephadex-Säule geladen wurde, gefolgt von einem chromatographischen Schritt auf einer Sepharose-4B-Säule, Ammoniumsulfatfällung und Dialyse^13. Beide Reinigungsprotokolle dauern 4-5 Tage. Escherichia coli α₂β₂ TS Komplex kristallisiert, aber Kristalle waren zu dieser Zeit nicht für die Röntgenbeugung geeignet.

In einer neuartigen Studie wurden rekombinante und Wildtypformen von S. typhimurium α₂β₂ TS-Komplex gereinigt und^{kristallisiert 14,15}. Der rekombinante α₂β₂StTS-Komplex wurde im E. coli-Stamm CB149 überexprimiert, der den pEBA-10-Expressionsvektor trug. Erste Kristallisations- und Röntgenbeugungsdatenerfassung und Analyse des α₂β₂StTS-Komplexes wurden berichtet¹⁴. Lange und dünne Nadeln wie α₂β₂StTS-Kristalle beeinträchtigten jedoch die Strukturstudien. In einem Versuch, bessere Röntgenbeugungsdaten zu sammeln, wurde ein anderes Reinigungsprotokoll beschrieben, um den Wildtyp und die mutierten Formen des α₂β₂StTS-Komplexes¹⁵zu reinigen. Die Reinigung erfolgte mit einer anfänglichen Ausfällung mit Spermin und PEG 8.000 in das geklärte Zelllysat und ein großer sperriger Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Die überstandige Fraktion, die hohe Mengen an α₂β₂StTS-Komplex enthielt, wurde 16-48 h bei 4 °C gelagert, bis gelbe Kristalle ausbrachen. Kristalle wurden gewaschen und ausgiebig gegen verschiedene Puffer dialysiert. Proteinkomplex wurde in Ammoniumsulfat enthaltenden Puffer rekristallisiert und dialysiert¹⁵. Obwohl die Proteinkristallisation von den Protein- und Fällungsmittelkonzentrationen in Lösung abhängt, ist es schwierig, die Reinigung für andere mutierte Formen des α₂β₂StTS-Komplexes in Lösung zu überwachen, vorherzusagen und zu reproduzieren. Dieses Protokoll hat den Vorteil, dass es keine chromatographischen Methoden verwendet; Die Nachteile sind jedoch die lange Reinigungszeit, die zum Kristallisieren, Dialysieren und Rekristallisieren erforderlich ist und typischerweise 5-7 Tage benötigt. Um Kristalle zu erhalten, die für die Röntgendatenerfassung geeignet sind, wurden mehr als 600 Kristallisationsbedingungen unter Verwendung einer Kombination und Variation von Proteinkonzentration, Temperatur, Fällungsmitteln (PEG 4.000, 6.000 und 8.000) und Additiven (CaCl₂, MnCl₂, ZnCl₂, Cadaverin, Putrescin, Spermin oder Spermidin)^{bewertet 15}. Kristalle hatten eine bessere kristalline Form und wuchsen schneller unter Bedingungen, die 12% PEG 8.000 und 2 mM Spermin enthielten. Die Kristallisation war bei 25 °C günstiger als bei 4, 30 oder 42 °C und wuchs innerhalb von 3 Tagen auf maximale Abmessungen^{an 15}. Mehrere α₂β₂StTS Kristallstrukturen wurden damals (1996-1999) berichtet^{16,17,18,19,20,21} und viele andere Strukturen wurden bis heute veröffentlicht.

Hier besteht der Hauptzweck darin, alternative Protokolle zur Reinigung der Tryptophansynthase und zur Optimierung der Proteinkristallisation vorzustellen. Die vorliegende Arbeit zeigt signifikante Verbesserungen zur Reinigung des Wildtyps isoliert α-Untereinheit (αStTS), isolierter β-Untereinheit (βStTS), rekonstituiert α₂β₂StTS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten, und Wildtyp- und Mutantenformen des α₂β₂StTS-Komplexes. Die Vorteile gegenüber früheren Protokollen sind beträchtlich, da die Reinigungszeit deutlich verkürzt und Kristallisation und Kryoprotektion optimiert wurden. Mutantenformen von α₂β₂StTS-Komplexes, die in dieser Arbeit entwickelt wurden, haben sich in der Nähe des gleichen Zustands kristallisiert, der für die Wildtypform verwendet wird. Eine Feinkristallisationsoptimierung war jedoch notwendig, um große Einkristalle von ausreichender Qualität für die Strukturbestimmung bei nahezu atomarer Auflösung zu erhalten. Bis heute sind in der Protein Data Bank (PDB) 134 Tryptophansynthase-Kristallstrukturen hinterlegt, die 101, 31 bzw. 2 Kristallstrukturen für Bakterien, Archaeen und Eukaryoten ausmachen. Schönerweise gehören 73 Strukturen zu S. enterica serovar typhimurium und 5 Kristallstrukturen des α₂β₂StTS-Komplexes haben Auflösungsgrenzen von mehr als 1,50 Angström. Es überrascht nicht, dass 4 von 5 in unserer Forschungsgruppe vorbereitet wurden (PDB IDs: 5CGQ bei 1,18 Å, 4HT3 bei 1,30 Å, 4HPJ bei 1,45 Å, 6DZ4 bei 1,45 Å Auflösung). Die raffinierten Kristallstrukturen der mutierten Form von α₂β₂StTS-Komplexes sollen neue Einblicke in den Mechanismus und die Rolle liefern, die essentielle Aminosäurereste bei der L-Tryptophan-Synthese spielen.

Protocol

1. Schnelles Protokoll zur Reinigung der α- und β-Untereinheit und des rekombinierten α2β2StTS-Komplexes DNA subklonieren in pETSUMO-ExpressionsvektorErhalten Sie das translational koppelnde Gen (trpA und trpB), das für die α-und β-Untereinheitender Tryptophansynthase aus dem Bakterium Salmonella enterica serovar typhimurium kodiert, das im pEBA-10-Expressionsvektor22geklont ist. Verwenden Sie den pEBA-10-V…

Representative Results

Reinigung der α-und β-Untereinheiten der Tryptophan-Synthase Die α-Untereinheit(αStTS) und die β-Untereinheit (βStTS) der Salmonella typhimurium tryptophan synthase wurden im modifizierten pET SUMO-Vektor subkloniert. Abbildung 1A zeigt repräsentative SDS-PAGE-Ergebnisse von zwei starken Bändern, die dem Fusionsprotein His6-SUMO-αStT…

Discussion

Wir haben erfolgreich mutierte Form α₂β₂ βQ114A, α₂β₂ βK167T und α₂β₂ βS377A StTS-Komplexe für Struktur-Funktions-Korrelationsstudien entwickelt. Zunächst haben wir versucht, die Mutanten mit einem früheren Reinigungsprotokoll²²zu reinigen, das α₂β₂StTS-Komplexkristallisation mit PEG 8000 und Spermin während der Reinigung erfordert. Obwohl die Kristallisationsrate von der mutant…

Materials

15 mL 10 kDa filter	MilliporeSigma	UFC901024	centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter	MilliporeSigma	UFC910024	centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials	Corning	CLS430489	Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-141	microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Chemical
50 mL centrifuge conical tubes	Thermo Scientific	12-565-270	centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH meter
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Agarose gel
ammonium sulfate	Fisher Scientific	A702-500	Chemical
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibiotic
Bacterial incubator	Fisher Scientific	S35836	incubator.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
bicine	Fisher Scientific	BP2646100	Chemical
Branson 450 Digital Sonifier	Brason	B450	Cell disruptor
Cesium chloride	Fisher Scientific	BP210-100	Chemical
Cesium hydroxide	Acros Organics	AC213601000	Chemical
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibiotic
dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D1391	Chemical
dithiothreitol	Fisher Scientific	BP172-5	Chemical
DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	HF polymerase
dNTP Set	Invitrogen	10-297-018	dNTPs set
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chemical
Excella E25R Orbital Shaker	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	FPLC
Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012	DNA purification kit
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	Chemical
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Restriction enzyme
His-Trap columns	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Histrap column
imidazole	Fisher Scientific	O3196-500	Chemical
IPTG	Thermo Fisher Scientific	R0392	Inducer
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibiotic
Kelvinator Series-100	Kelvinator	discontinued	Ultra low freezer
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-500	Liquid broth
Luria Bertani agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Solid broth
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Chemical
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA agarose beads
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride	Fisher Scientific	44-865-0	Chemical
pyridoxal phosphate	Acros Organics	AC228170010	Chemical
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Size exclusion column
SacI	New England Biolabs	R0156S	Restriction enzyme
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-100	Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge	Sorvall	8327-30-1004	Floor cetrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 prep grade	Cytiva	45-002-491	Size exclusion column
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S	DNA liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Chemical
Ubl-specific protease 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Protease