Voorbereiding van gedecellulariseerde niersteigers bij ratten
Summary
Dit protocol introduceert een methode om een steiger te ontwikkelen met behulp van gedecellulariseerde rattennieren. Het protocol omvat decellularisatie- en recellularisatieprocessen om de biologische beschikbaarheid te bevestigen. Decellularisatie wordt uitgevoerd met Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat.
Abstract
Tissue engineering is een geavanceerde discipline in de biogeneeskunde. Celkweektechnieken kunnen worden toegepast voor regeneratie van functionele weefsels en organen ter vervanging van zieke of beschadigde organen. Steigers zijn nodig om de generatie van driedimensionale organen of weefsels te vergemakkelijken met behulp van gedifferentieerde stamcellen in vivo. In dit rapport beschrijven we een nieuwe methode voor het ontwikkelen van gevasculariseerde steigers met behulp van gedecellulariseerde rattennieren. Acht weken oude Sprague-Dawley ratten werden gebruikt in deze studie, en heparine werd geïnjecteerd in het hart om de stroom in de niervaten te vergemakkelijken, waardoor heparine in de niervaten kon doordringen. De buikholte werd geopend en de linkernier werd verzameld. De verzamelde nieren werden gedurende 9 uur geperfuseerd met behulp van detergentia, zoals Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat, om het weefsel te decellulariseren. Gedecellulariseerde niersteigers werden vervolgens voorzichtig gewassen met 1% penicilline/streptomycine en heparine om cellulair puin en chemische residuen te verwijderen. Transplantatie van stamcellen met de gedecellulariseerde vasculaire steigers zal naar verwachting de generatie van nieuwe organen vergemakkelijken. Zo kunnen de gevasculariseerde steigers in de toekomst een basis vormen voor weefseltechnologie van orgaantransplantaten.
Introduction
Celkweektechnieken worden toegepast voor regeneratie van functionele weefsels en organen ter vervanging van zieke of beschadigde organen. Allogene orgaantransplantatie is momenteel de meest voorkomende behandeling voor onomkeerbare orgaanschade; deze aanpak vereist echter het gebruik van immunosuppressie om afstoting van het getransplanteerde orgaan te voorkomen. Bovendien kan, ondanks de vooruitgang in de transplantatieimmunologie, 20% van de transplantatieontvangers binnen 5 jaar acute afstoting ervaren en binnen 10 jaar na transplantatie kan 40% van de ontvangers hun getransplanteerde transplantaat verliezen of sterven1.
Vooruitgang in weefseltechnologietechnologieën heeft geleid tot een nieuw paradigma voor transplantatie van nieuwe organen zonder immuunafstoting met behulp van gedifferentieerde stamcellen. Na stamceldifferentiatie is een steiger nodig, een synthetische extracellulaire matrix genaamd, om de generatie van driedimensionale organen te vergemakkelijken en het nieuwe weefsel in staat te stellen te gedijen in de ontvanger. Steigers van gedecellulariseerde inheemse organen hebben voordelen, waaronder een effectievere omgeving voor de vestiging van cellen en verbetering van de proliferatie van stamcellen, hoewel deze mechanismen niet volledig zijn opgehelderd2. In het bijzonder is de nier een geschikt orgaan voor steigergeneratie omdat het een overvloedige circulatie heeft en een niche voor stamcelinrichting. Bovendien is het vanwege de complexe structuur van de nier moeilijk om nieren kunstmatig te regenereren voor orgaantransplantatie.
In dit rapport introduceren we een methode om gevasculariseerde steigers te ontwikkelen met behulp van gedecellulariseerde organen in een rattenmodel om toekomstige dierstudies voor weefseltechnologiedoeleinden te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende protocollen zijn gebruikt voor decellularisatie van organen en andere weefsels. Het optimale decellularisatieprotocol moet de driedimensionale architectuur van de extracellulaire matrix (ECM) behouden. Over het algemeen bestaan dergelijke protocollen uit het lyseren van het celmembraan door fysieke verwerking of ionische oplossingen, het scheiden van het cytoplasma en de kern van het ECM door enzymatische verwerking of detergentia, en vervolgens het verwijderen van cellulair puin uit het weefsel<sup class="…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door een Biomedical Research Institute Grant van pusan National University Hospital.
Materials
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
Referenzen
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
