إعداد سقالات الكلى المزيلة في الفئران
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة لتطوير سقالة باستخدام كليتي الفئران المزيلتين. ويشمل البروتوكول عمليات الازالة وإعادة الخلايا لتأكيد التوافر البيولوجي. يتم تنفيذ إزالة الخلايا باستخدام تريتون X-100 وكبريتات دودسيل الصوديوم.
Abstract
هندسة الأنسجة هي تخصص متطور في الطب الحيوي. يمكن تطبيق تقنيات زراعة الخلايا لتجديد الأنسجة والأعضاء الوظيفية لتحل محل الأعضاء المريضة أو التالفة. هناك حاجة إلى السقالات لتسهيل توليد الأعضاء أو الأنسجة ثلاثية الأبعاد باستخدام الخلايا الجذعية المتمايزة في الجسم الحي. في هذا التقرير، نصف طريقة جديدة لتطوير السقالات الوعائية باستخدام كلى الفئران المزيلة. استخدمت فئران سبراغ دولي البالغة من العمر ثمانية أسابيع في هذه الدراسة، وتم حقن الهيبارين في القلب لتسهيل التدفق إلى الأوعية الكلوية، مما سمح للهابارين بالتغلغل في الأوعية الكلوية. فتح تجويف البطن، وتم جمع الكلى اليسرى. تم تغلغل الكلى التي تم جمعها لمدة 9 ساعة باستخدام المنظفات ، مثل تريتون X-100 وكبريتات دودسيل الصوديوم ، لإزالة الخلايا النسيجية. ثم تم غسل سقالات الكلى منزوعة الخلايا بلطف مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين والهبارين لإزالة الحطام الخلوي والمخلفات الكيميائية. ومن المتوقع زرع الخلايا الجذعية مع السقالات الأوعية الدموية decellularized لتسهيل توليد أجهزة جديدة. وبالتالي ، قد توفر السقالات الوعائية أساسا لهندسة الأنسجة لترقيع الأعضاء في المستقبل.
Introduction
يتم تطبيق تقنيات زراعة الخلايا لتجديد الأنسجة والأعضاء الوظيفية لتحل محل الأعضاء المريضة أو التالفة. زرع الأعضاء المسببة للألوجين هو حاليا العلاج الأكثر شيوعا لتلف الأعضاء لا رجعة فيه; ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج استخدام كبت المناعة لمنع رفض العضو المزروع. وعلاوة على ذلك، على الرغم من التقدم في علم المناعة زرع، 20٪ من المتلقين زرع قد تواجه رفض حاد في غضون 5 سنوات، وخلال 10 سنوات بعد زرع، 40٪ من المتلقين قد تفقد الكسب غير المشروع المزروعة أو يموت1.
وقد أثمر التقدم في تقنيات هندسة الأنسجة في نموذج جديد لزرع أعضاء جديدة دون رفض المناعة باستخدام الخلايا الجذعية المتمايزة. بعد تمايز الخلايا الجذعية ، هناك حاجة إلى سقالة ، تسمى مصفوفة اصطناعية خارج الخلية ، لتسهيل توليد الأعضاء ثلاثية الأبعاد وتمكين الأنسجة الجديدة من الازدهار داخل المتلقي. السقالات من الأعضاء الأصلية decellularized لها مزايا، بما في ذلك بيئة أكثر فعالية لإنشاء الخلايا وتعزيز انتشار الخلايا الجذعية، على الرغم من أن هذه الآليات لم يتم توضيحها تماما2. على وجه الخصوص ، الكلى هي جهاز مناسب لتوليد السقالات لأنها تحتوي على تداول وفير ومكانة لإنشاء الخلايا الجذعية. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب الهيكل المعقد للكلى ، من الصعب تجديد الكلى بشكل مصطنع لزرع الأعضاء.
في هذا التقرير، نقدم طريقة لتطوير السقالات الوعائية باستخدام الأعضاء المزيلة في نموذج الفئران لتسهيل الدراسات الحيوانية المستقبلية لأغراض هندسة الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت بروتوكولات مختلفة لdeellularization من الأعضاء والأنسجة الأخرى. يجب أن يحافظ بروتوكول التفكيك الأمثل على البنية ثلاثية الأبعاد للمصفوفة خارج الخلية (ECM). بشكل عام ، تتكون هذه البروتوكولات من ليسينج غشاء الخلية عن طريق المعالجة الفيزيائية أو الحلول الأيونية ، وتفكيك السيتوبلازم والنو…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة معهد البحوث الطبية الحيوية من مستشفى جامعة بوسان الوطنية.
Materials
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
Referenzen
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
