Meting van de striale bloedstroom in slakkenhuis van muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie
Summary
Een open vaatvensterbenadering met behulp van fluorescerende tracers biedt voldoende resolutie voor cochleaire bloedstroom (CoBF) -meting. De methode vergemakkelijkt de studie van structurele en functionele veranderingen in CoBF bij muizen onder normale en pathologische omstandigheden.
Abstract
Transductie van geluid is metabolisch veeleisend en de normale functie van de microvasculatuur in de laterale wand is van cruciaal belang voor het behoud van endocochleaire potentiaal, ionentransport en vloeistofbalans. Verschillende vormen van gehoorstoornissen worden gemeld met abnormale microcirculatie in het slakkenhuis. Onderzoek naar hoe cochleaire bloedstroom (CoBF) pathologie de gehoorfunctie beïnvloedt, is een uitdaging vanwege het gebrek aan haalbare ondervragingsmethoden en de moeilijkheid om toegang te krijgen tot het binnenoor. Een open vaatvenster in de laterale cochleaire wand, gecombineerd met fluorescentie intravitale microscopie, is gebruikt voor het bestuderen van CoBF-veranderingen in vivo, maar meestal bij cavia’s en pas onlangs bij de muis. Dit artikel en de bijbehorende video beschrijven de open vaatvenstermethode voor het visualiseren van de bloedstroom in het slakkenhuis van de muis. Details omvatten 1) bereiding van de fluorescerend gelabelde bloedcelsuspensie van muizen; 2) constructie van een open vaatvenster voor intravitale microscopie in een verdoofde muis, en 3) meting van de bloedstroomsnelheid en -volume met behulp van een offline opname van de beeldvorming. De methode wordt gepresenteerd in videoformaat om te laten zien hoe de open vensterbenadering in de muis kan worden gebruikt om structurele en functionele veranderingen in de cochleaire microcirculatie onder normale en pathologische omstandigheden te onderzoeken.
Introduction
De normale functie van de microcirculatie in de laterale cochleaire wand (bestaande uit de meerderheid van de haarvaten in het spiraalvormige ligament en de stria vascularis) is van cruciaal belang voor het behoud van de gehoorfunctie1. Abnormale CoBF is betrokken bij de pathofysiologie van veel binnenooraandoeningen, waaronder lawaai-geïnduceerd gehoorverlies, oorhydrops en presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisatie van intravitale CoBF zal een beter begrip mogelijk maken van de verbanden tussen gehoorfunctie en cochleaire vasculaire pathologie.
Hoewel de complexiteit en locatie van het slakkenhuis in het temporale bot directe visualisatie en meting van CoBF uitsluit, zijn er verschillende methoden ontwikkeld voor de beoordeling van CoBF, waaronder laser-doppler flowmetrie (LDF)10,11,12, magnetische resonantie beeldvorming (MRI)13, fluorescentie intravitale microscopie (FIVM)14, fluorescentiemicro-endoscopie (FME)15, endoscopische laser spikkelcontrast beeldvorming (LSCI)16 , en benaderingen op basis van de injectie van gelabelde markers en radioactief gelabelde microsferen in de bloedbaan (optische microangiografie, OMAG)17,18,19,20. Geen van deze methoden heeft echter absolute real-time tracking van veranderingen in CoBF in vivo mogelijk gemaakt, met uitzondering van FIVM. FIVM, in combinatie met een vessel-window in de laterale cochleaire wand, is een aanpak die bij cavia’s onder verschillende experimentele omstandigheden door verschillende laboratoria is gebruikt en gevalideerd 14,21,22.
Een FIVM-methode werd met succes ontwikkeld voor het bestuderen van de structurele en functionele veranderingen in de cochleaire microcirculatie bij muizen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran als contrastmiddel en een fluorescentiekleurstof – ofwel DiO (3, 3 ′-dioctadecyloxacarbocyanineperchloraat, groen) of Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3-tetramethylindocarbocyanineperchloraat, rood) – voor het vooraf labelen van bloedcellen, het visualiseren van bloedvaten en het volgen van de bloedstroomsnelheid. In deze studie is het protocol van deze methode beschreven voor het afbeelden en kwantificeren van veranderingen in CoBF bij muizen onder normale en pathologische omstandigheden (zoals na blootstelling aan lawaai). Deze techniek geeft de onderzoeker de tools die nodig zijn om de onderliggende mechanismen van CoBF met betrekking tot gehoordisfunctie en pathologie in de stria vascularis te onderzoeken, vooral wanneer toegepast in combinatie met direct beschikbare transgene muismodellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel laat zien hoe haarvaten in de cochleaire laterale wand (en in de stria vascularis) van een muismodel kunnen worden gevisualiseerd met fluorofooretikettering in een open vaatvenstervoorbereiding onder een FIVM-systeem. Muismodel wordt veel gebruikt en heeft de voorkeur als zoogdiermodel voor het onderzoeken van de menselijke gezondheid en ziekte. Het hier beschreven protocol is een haalbare benadering voor het afbeelden en onderzoeken van CoBF in de zijwand van de muis (met name in de stria vascularis) met beh…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) en Medical Research Foundation van Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
Referenzen
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc’h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
