Процедуры трансплантации костного мозга у мышей для изучения клонального кроветворения
Summary
Описаны три метода трансплантации костного мозга (ТКМ): ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с экранированной облучающей и метод ТКМ без предварительного кондиционирования (адютивная ТКМ) для изучения клонального кроветворения на мышиных моделях.
Abstract
Клональный кроветворение является распространенным возрастным состоянием, которое является результатом накопления соматических мутаций в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках (HSPC). Мутации в генах-драйверах, которые придают клеточную пригодность, могут привести к развитию расширяющихся клонов HSPC, которые все чаще приводят к появлению лейкоцитов потомства, скрывающих соматическую мутацию. Поскольку клональное кроветворение было связано с сердечными заболеваниями, инсультом и смертностью, разработка экспериментальных систем, моделируемых эти процессы, является ключом к пониманию механизмов, лежащих в основе этого нового фактора риска. Процедуры трансплантации костного мозга, включающие миелоаблативное кондиционирование у мышей, такие как облучение всего тела (ЧМТ), обычно используются для изучения роли иммунных клеток в сердечно-сосудистых заболеваниях. Тем не менее, одновременное повреждение ниши костного мозга и других интересных мест, таких как сердце и мозг, неизбежно при этих процедурах. Таким образом, наша лаборатория разработала два альтернативных метода, чтобы свести к минимуму или избежать возможных побочных эффектов, вызванных ЧМТ: 1) трансплантация костного мозга с экранированием облучения и 2) приемная ТКМ неусловным мышам. В экранированных органах сохраняется местная среда, позволяющая проводить анализ клонального кроветворения, в то время как функция резидентных иммунных клеток невозмутима. Напротив, приемная ТКМ для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, за которое сохраняются как местные среды органов, так и кроветворная ниша. Здесь мы сравним три различных подхода к восстановлению кроветворных клеток и обсудим их сильные и слабые стороны для исследований клонального кроветворения при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Introduction
Клональное кроветворение (CH) – это состояние, которое часто наблюдается у пожилых людей и возникает в результате расширенного клона гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC), несущего генетическую мутацию1. Было высказано предположение, что к 50 годам большинство людей приобретут в среднем пять экзонических мутаций в каждом HSPC2,но большинство из этих мутаций приведут к небольшим фенотипическим последствиям для человека или вообще не приведут к ним. Однако, если случайно одна из этих мутаций дает конкурентное преимущество HSPC, например, способствуя его распространению, самообновлению, выживанию или некоторой комбинации из них, это может привести к предпочтительному расширению мутантного клона по сравнению с другими HSPC. В результате мутация будет все больше распространяться через кроветворную систему, поскольку мутированный HSPC дает начало зрелым клеткам крови, что приводит к отчетливой популяции мутировавших клеток в периферической крови. В то время как мутации в десятках различных генов-драйверов-кандидатов были связаны с клональными событиями в кроветворной системе, среди них мутации в ДНК-метилтрансферазе 3 альфа(DNMT3A)и десяти одиннадцати транслокации 2(TET2)являются наиболее распространенными3. Несколько эпидемиологических исследований показали, что лица, которые несут эти генетические мутации, имеют значительно более высокий риск сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), инсульта и всей причинной смертности3,4,5,6,7. Хотя эти исследования выявили, что существует связь между СН и повышенной частотой сердечно-сосудистых заболеваний и инсульта, мы не знаем, является ли эта связь причинно-следственной или общей эпифеноменом с процессом старения. Чтобы лучше понять эту ассоциацию, требуются надлежащие животные модели, которые правильно резюмируют состояние СН человека.
Несколько моделей животных CH были установлены нашей группой и другими с использованием рыбок данио, мышей и нечеловеческих приматов8,9,10, 11,12,13,14. Эти модели часто используют методы восстановления кроветворения путем трансплантации генетически модифицированных клеток, иногда с использованием рекомбинации Cre-lox или системы CRISPR. Этот подход позволяет проанализировать специфическую мутацию гена в кроветворных клетках, чтобы оценить, как она способствует развитию заболевания. Кроме того, эти модели часто используют конгенные или репортерные клетки, чтобы отличить эффекты мутантных клеток от нормальных или диких клеток. Во многих случаях требуется режим предварительного кондиционирования для успешного приживирования донорских гемопоэтических стволовых клеток.
В настоящее время трансплантацию костного мозга мышам-реципиенцистам можно разделить на две основные категории: 1) миелоаблативное кондиционирование и 2) неусловная трансплантация. Миелоаблативное кондиционирование может быть достигнуто одним из двух методов, а именно, общим облучением тела (ЧМТ) или химиотерапией15. ЧМТ проводят путем подвергания реципиента смертельной дозе гамма- или рентгеновского облучения, генерирующего разрывы ДНК или поперечные связи внутри быстро делящихся клеток, делая их непоправимыми16. Бусульфан и циклофосфамид являются двумя широко используемыми химиотерапевтическими препаратами, которые нарушают кроветворную нишу и аналогичным образом вызывают повреждение ДНК быстро делящихся клеток. Конечным результатом миелоаблативного прекондиционирования является апоптоз кроветворных клеток, который разрушает кроветворную систему реципиента. Эта стратегия не только позволяет успешно приживить донорские HSPC, но также может предотвратить отторжение трансплантата путем подавления иммунной системы реципиента. Тем не менее, миелоаблативная прекондиционирование имеет серьезные побочные эффекты, такие как повреждение тканей и органов и их резидентных иммунных клеток, а также разрушение родной ниши костного мозга17. Поэтому были предложены альтернативные методы преодоления этих нежелательных побочных эффектов, особенно в отношении повреждения органов, представляющих интерес. Эти методы включают экранированное облучение мышей-реципиентов и приемную ТКМ для неусловленных мышей9,17. Защита грудной клетки, брюшной полости, головы или других областей от облучения путем размещения свинцовых барьеров защищает интересующие ткани от повреждающего воздействия облучения и поддерживает их резидентную популяцию иммунных клеток. С другой стороны, приемная ТКМ HSPC для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, поскольку она сохраняет нативную кроветворную нишу. В этой рукописи мы описываем протоколы и результаты приживления HSPC после нескольких схем трансплантации у мышей, в частности доставки HSPC мышам ЧМТ, мышам, частично защищенным от облучения, и неусловным мышам. Общая цель состоит в том, чтобы помочь исследователям понять различные физиологические эффекты каждого метода, а также то, как они влияют на экспериментальные результаты в условиях СН и сердечно-сосудистых заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для исследований клонального кроветворения мы описали три метода ТКМ: ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с облучением с частичным экранированием и менее часто используемый метод ТКМ, который не включает предварительное кондиционирование (адмтивное ТКМ). Эти методы были использованы для …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США К. Уолшу (HL131006, HL138014 и HL132564), С. Сано (HL152174), грантом Американской кардиологической ассоциации М. А. Эвансу (20POST35210098) и грантом Японского фонда сердца Х. Огава.
Materials
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
Referenzen
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
