ذبابة الرمل (Phlebotomus باباتاسي) الجنين الميكروبيكشن ل CRISPR/Cas9 موتاجينيسيس
Summary
يفصل هذا البروتوكول خطوات تكوين الحشرات المستهدف CRISPR/Cas9 في ذباب الرمل: جمع الأجنة، والحقن، وتربية الحشرات، وتحديد الهوية، فضلا عن اختيار الطفرات ذات الاهتمام.
Abstract
الذباب الرملي هو النواقل الطبيعية لأنواع الليشمانيا ، الطفيليات البروتوزوانية التي تنتج طيفا واسعا من الأعراض التي تتراوح بين الآفات الجلدية إلى علم الأمراض الحشوي. فك طبيعة التفاعلات ناقلات / الطفيلي هو ذات أهمية أساسية لفهم أفضل لانتقال الليشمانيا إلى مضيفيهم. ومن بين البارامترات التي تتحكم في كفاءة ناقلات ذبابة الرمل (أي قدرتها على حمل مسببات الأمراض ونقلها)، تبين أن البارامترات المتأصلة في هذه الحشرات تلعب دورا رئيسيا. الاستجابة المناعية للحشرات ، على سبيل المثال ، تؤثر على كفاءة ناقلات ذبابة الرمل إلى الليشمانيا. وكانت دراسة هذه المعلمات محدودة بسبب عدم وجود أساليب لتعديل التعبير الجيني مكيفة للاستخدام في هذه الكائنات غير النموذجية. التنظيم الجيني من قبل الجيش الملكي النيبالي التدخل الصغيرة (siRNA) ممكن، ولكن بالإضافة إلى كونها صعبة من الناحية الفنية، وإسكات يؤدي إلى فقدان جزئي فقط للوظيفة، والتي لا يمكن أن تنتقل من جيل إلى جيل. تم مؤخرا تكييف mutagenesis المستهدفة من قبل التكنولوجيا CRISPR / Cas9 لذبابة الرمال Phlebotomus papatasi. تؤدي هذه التقنية إلى توليد طفرات قابلة للإنتهاك في مكان تم اختياره خصيصا ، مما يسمح بدراسة الجينات ذات الاهتمام. يعتمد نظام CRISPR/Cas9 على تحريض فواصل الحمض النووي المزدوجة المستهدفة ، التي تم إصلاحها لاحقا إما عن طريق الانضمام إلى النهاية غير المثلية (NHEJ) أو عن طريق إصلاح مدفوع بالهومولوجيا (HDR). يتكون NHEJ من إغلاق بسيط للكسر ويؤدي في كثير من الأحيان إلى أحداث الإدراج / الحذف الصغيرة. في المقابل ، يستخدم HDR وجود جزيء الحمض النووي المانح الذي يشارك علم الأوهام مع الحمض النووي المستهدف كنموذج للإصلاح. هنا ، نقدم طريقة التجميل الدقيق لجنين ذبابة الرمل للطفرات المستهدفة من قبل CRISPR / Cas9 باستخدام NHEJ ، وهي تقنية تعديل الجينوم الوحيدة المكيفة مع ناقلات ذبابة الرمل حتى الآن.
Introduction
تشكل الأمراض المنقولة بالنواقل تهديدا رئيسيا للصحة العامة في تطور مستمر. مئات الأنواع الناقلة المنتشرة عبر أسر فيلوجينية متميزة جدا (مثل البعوض والقراد والبراغيث) هي المسؤولة عن انتقال عدد كبير من مسببات الأمراض الميكروبية، مما يؤدي إلى أكثر من 700،000 حالة وفاة بشرية سنويا، وفقا لمنظمة الصحة العالمية. ومن بين الحشرات الناقلة، يشكل ذباب الرمل البلوبوتومين (Diptera, Psychodidae) مجموعة واسعة، حيث يظهر 80 نوعا من ناقلات الأمراض المثبتة سمات وصفية وقدرات متجهية متميزة موجودة في مناطق جغرافية مختلفة. وهي ناقلات لطفيليات البروتوزوان من جنس الليشمانيا، مما تسبب في حوالي 1.3 مليون حالة جديدة من الليشمانيات وبين 20،000 و 30،000 حالة وفاة سنويا. نتائج الليشمانيات السريرية متنوعة ، مع أعراض تتراوح بين الآفات الجلدية ذاتية الحد إلى النشر الحشوي الذي هو قاتل في غياب العلاج.
ذباب الرمل هي الحشرات الأرضية البحتة. تستمر دورة حياتها، الطويلة نسبيا مقارنة ب Diptera الأخرى، لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر، اعتمادا على معايير مختلفة مثل درجة الحرارة والرطوبة والتغذية. وهو يتألف من مرحلة جنينية واحدة (من 6 إلى 11 يوما)، وأربع مراحل يرقية (تدوم ما مجموعه 23 إلى 25 يوما) ومرحلة جروة واحدة (من 9 إلى 10 أيام) يليها التحول ثم البلوغ. الذباب الرملي يتطلب بيئة رطبة ودافئة للتربية. يتغذى كل من الذكور والإناث على السكريات ، التي يتم الحصول عليها في البرية من رحيق الزهور. الإناث فقط هي مغذيات الدم، لأنها تتطلب البروتينات التي تم الحصول عليها من وجبة الدم لإنتاج البيض1.
ومن مجالات التركيز الهامة للبحوث تحديد طبيعة التفاعلات بين ناقلات الأمراض/الطفيليات التي تؤدي إلى تطور العدوى المنقولة. وكما هو الحال مع الحشرات الناقلة الأخرى، ثبت أن البارامترات المتأصلة في ذباب الرمل تؤثر على كفاءتها في ناقلات الأمراض، والتي تعرف بأنها قدرتها على حمل مسببات الأمراض ونقلها إلى مضيفيهم. على سبيل المثال ، يمكن للتعبير عن galectins بواسطة الرمال Phlebotomus papatasi يطير الخلايا midgut ، بوصفها مستقبلات التعرف على مكونات سطح الطفيلي ، تؤثر مباشرة على كفاءتها ناقلات للليشمانيا الرئيسية2،3. مسار الاستجابة المناعية للحشرات ، نقص المناعة (IMD) ، هو أيضا حاسم لكفاءة ناقلات ذبابة الرمال Phlebotomus papatasi للليشمانيا الرئيسية 4. كما تم الإبلاغ عن دور حاسم لمسارات الاستجابة المناعية للحشرات الناقلة في السيطرة على انتقالها لمسببات الأمراض المعدية في بعوض Aedes aegypti 5و6و7، في ذبابة تسيتسي Glossina morsitans8، وفي بعوض Anopheles gambiae 9،10.
وقد تم الحد من دراسات ذبابة الرمل /التفاعلات الليشمانيا بسبب عدم وجود طرق تعديل التعبير الجيني تكييفها للاستخدام في هذه الحشرات. فقط تنظيم الجينات من قبل الجيش الملكي النيبالي التدخل الصغيرة (siRNA) قد أجريت11،12،13،14 حتى وقت قريب. ولا تؤدي هذه التقنية، التي تحد منها الوفيات المرتبطة بالحرمان الدقيق للإناث البالغات، إلا إلى فقدان جزئي للوظيفة، لا يمكن أن ينتقل من جيل إلى جيل.
أحدثت تقنية CRISPR/Cas9 ثورة في البحوث الجينومية الوظيفية في الكائنات غير النموذجية مثل ذباب الرمل. تم تعديل نظام المناعة التكيفي في prokaryotes للدفاع ضد البكتيريا15،16، تم تكييف نظام CRISPR Cas9 بسرعة كأداة لتحرير الجينوم للكائنات الحية eukaryotic متفوقة ، بما في ذلك الحشرات. ويستند مبدأ CRISPR/Cas9 المستهدفة الجينوم التحرير على التكامل من الحمض النووي الريبي دليل واحد (sgRNA) إلى مكان الجينوم محددة. ترتبط نواة Cas9 بالسرنا وتخلق كسر الحمض النووي المزدوج (dsDNA) في الحمض النووي الجينومي حيث يرتبط sgRNA بتسلسلها التكميلي. يتم توجيه مجمع Cas9-sgRNA إلى التسلسل المستهدف من خلال 17 إلى 20 قاعدة تكميلية في sgRNA إلى الموضع المختار ، ويمكن بعد ذلك إصلاح كسر dsDNA بواسطة مسارين مستقلين: نهاية انضمام nonhomologous (NHEJ) أو إصلاح موجهة بالهومولوجيا (HDR)17. إصلاح NHEJ ينطوي على إغلاق بسيط للكسر ولكن كثيرا ما يؤدي إلى أحداث الإدراج / الحذف الصغيرة. إصلاح الحمض النووي من خلال تقرير التنمية البشرية يستخدم جزيء الحمض النووي المانحة تقاسم homology مع الحمض النووي الهدف كنموذج للإصلاح. تمتلك الحشرات كلا الجهازين.
يمكن أن تولد تقنية CRISPR/Cas9 طفرات في مكان مختار ، من خلال مسار إصلاح NHEJ ؛ أو لاستراتيجيات تحرير الجينوم الأكثر تعقيدا، مثل طرق أو مراسلي التعبير، من خلال مسار HDR مع قالب المانح المناسب. في ذباب الرمل ، تم إنشاء الأليل المتحولة الخالية من عامل الاستجابة المناعي Relish من خلال CRISPR بوساطة NHEJ في Phlebotomus papatasi4. كما تم حقن أجنة ذبابة الرمل في دراسة أخرى مع مزيج CRISPR/Cas9 الذي يستهدف ترميز الجينات الأصفر. ومع ذلك ، لم يتم إنتاج أي بالغين يحملون الطفرة18. ونصف هنا طريقة مفصلة لتولد ذبابة الرمل المستهدفة من قبل CRISPR/Cas9 بوساطة NHEJ ، مع التركيز بشكل خاص على التجميل الدقيق للجنين ، وهي خطوة حاسمة في البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نقدم هنا طريقة التلقيح الدقيق الجنين التي تم تطويرها مؤخرا لتولد الطفرات المستهدفة من قبل CRISPR / Cas9 في ذباب الرمال Phlebotomus papatasi. تم تطوير الميكرونجيكشن الجنيني للتعديل الوراثي للحشرات في دروسوفيلا في منتصف الثمانينيات21 ويستخدم الآن بشكل روتيني في مجموعة واسعة من ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون فانيسا ميلدينر هاريل على القراءة النقدية للمخطوطة.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
Referenzen
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant’Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant’anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant’Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
