DNA halo preparatlarının floresan in situ hibridizasyon ile birleştirilmesi, nükleoiskelet ile genomik etkileşimlerin yüksek çözünürlüklü analizini sağlar. Bağlı genom, artık ekstrakte edilen çekirdeklerin içinde bulunan hibridize floresan sinyallere yol açarken, bağlı olmayan genom, artık çekirdekleri çevreleyen DNA halesindedir.
Genom, aktivitesini düzenlemek ve belirli yerlere demirlemek için hücre çekirdeği içindeki çeşitli yapılarla ilişkilidir. Bu yapılar toplu olarak nükleoiskelet olarak bilinir ve nükleer lamina, nükleoller ve nükleer cisimleri içerir. Genomu ve organizasyonunu incelemek için birçok floresan in situ hibridizasyon (FISH) varyantı bulunmasına rağmen, bunlar genellikle çözünürlükle sınırlıdır ve genomun nükleer yapılarla ilişkisi hakkında yetersiz bilgi sağlar. DNA halo yöntemi, genom içindeki bağlanma bölgeleri aracılığıyla çekirdeklerdeki yapılara bağlı kalan DNA döngüleri üretmek için yüksek tuz konsantrasyonları ve iyonik olmayan deterjanlar kullanır. Burada, nükleer matrise sıkıca bağlı olmayan histonlar, lipitler ve DNA gibi çözünür nükleer proteinler ekstrakte edilir. Bu, iç nükleer yapılar ve ekstraksiyona dirençli proteinlerle yakından ilişkili DNA’yı içeren artık bir çekirdeği çevreleyen bağlanmamış bir DNA halesinin oluşumuna yol açar. Bu genişletilmiş DNA iplikçikleri artan çözünürlüğü mümkün kılar ve fiziksel haritalamayı kolaylaştırabilir. FISH ile kombinasyon halinde, bu yöntem, genomun demirlendiği tüm yapılarla genomik etkileşimleri incelemenin ek avantajına sahiptir. HALO-FISH olarak adlandırılan bu teknik, DNA halelerinin gen lokuslarını, tüm kromozomları, alfa uydusunu, telomerleri ve hatta RNA’yı ortaya çıkarmak için nükleik asit probları ile birleştirilebildiği çok yönlüdür. Bu teknik, normal hücrelerde ve kanser gibi hastalık ilerlemesinde nükleer organizasyon ve işlev hakkında bir fikir verir.
“Nükleer matris” ilk olarak 1974 yılında Berezney ve Coffey tarafından tanımlanmıştır1. Sıçan karaciğer çekirdekleri üzerinde yüksek tuz molariteleri ve nükleaz tedavisi ile ekstraksiyonlar yaptıktan sonra, proteinli bir yapısal çerçeve tanımladılar. DNA halo prosedürü daha sonra bu yöntemden uyarlandı ve çözünür proteinlerin uzaklaştırılmasını içerir, böylece sadece nükleer matris (NM) ve NM ile ilişkili proteinler ve kromozomlar devam eder. DNA bağlanma bölgeleri, DNA döngülerinin tabanında bulunur ve sırasıyla yüksek tuz konsantrasyonları ve iyonik deterjan lityum-3,5-diiyodosalisilat (LIS) ile ekstraksiyona dirençli matrise bağlı bölgeler (MAR’lar) veya iskele bağlanma bölgeleri (SAR’lar) olarak adlandırılır. DNA halelerinde, MAR’lar / SAR’larla ilişkili DNA, artık çekirdek içinde bağlanırken, DNA döngüleri bu bölgelerden uzağa uzanır ve DNA halesini oluşturur. Artık genomun lamina ile ilişkili alanlar (LAD’ler) aracılığıyla nükleer laminaya ve nükleolar ilişkili bölgeler (NAD’ler) ve muhtemelen spesifik nükleer cisimler gibi diğer nükleer yapılar aracılığıyla demirlendiğini biliyoruz.
DNA halo yöntemi, DNA’nın, genlerin ve kromozomal bölgelerin fiziksel haritalanması için kullanılabilir, çünkü genişletilmiş DNA ve kromatin daha büyük bir çözünürlük sağlar, çünkü kromatin histonlardan sıyrılır ve DNA 2,3,4,5,6’ya uzatılır. Bununla birlikte, bu uygulama için DNA halelerini kullanırken bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, DNA halelerinin artık çekirdekleriyle sıkı sıkıya ilişkili DNA’ya problar tarafından erişilemez, böylece analiz ve fiziksel haritalama6’dan uzak durulabilir. Fiber-FISH 2,4,5,7 ve moleküler tarama 8 gibi diğer teknikler de fiziksel haritalamayı mümkün kılar ve nispeten hızlı ve gerçekleştirilmesi kolay olma avantajına sahiptir. Her ikisi de tercihen DNA haleleri üzerinden genlerin DNA haritalaması için kullanılır. Bu yöntemler, çekirdekten çözücü veya tuz ekstraksiyonları kullanarak kromatin liflerini çıkarır, ancak moleküler tarama daha iyi tekrarlanabilirliğe sahip olma eğilimindedir 8,9.
Nükleoiskeletin, DNA için bağlanma bölgeleri, kromatin yeniden modellemesi, DNA transkripsiyonu, DNA onarımı ve DNA replikasyonu gibi önemli nükleer süreçleri desteklemede rol oynadığına dair artan kanıtlar vardır11,12. Bu nedenle, DNA halo tekniği, bu hücresel aktiviteler sırasında nükleoiskelet ve genom arasındaki etkileşimleri araştırmak için geliştirilmiştir ve araştırmalarda rutin olarak kullanılmış ve rapor edilmiştir. Bu teknik aynı zamanda genom ve nükleoiskelet arasındaki etkileşimleri, nükleer yapıdaki malignite ile ilişkili değişikliklerin tanımlandığı hastalık ilerlemesi ile ilişkili olarak araştırmak için de kullanılmıştır11.
DNA halo tekniği, gelişim ve farklılaşma sırasında genom ve nükleoiskelet arasındaki ilişkiyi araştırmak için de kullanılmıştır12. Bir dizi çalışma, FISH14 ile birleştiğinde halosperm 13 veya SpermHalo-FISHolarak bilinen DNA halo tekniğinin bir varyasyonunu kullanmıştır. Spermatozoa kromatini, protaminler olarak bilinen proteinlere sıkıca bağlanır ve bu teknik, sperm DNA’sına erişimi iyileştirmek için geliştirilmiştir. Halosperm, spermatozoa DNA’sının bütünlüğünü araştırmak ve DNA hasarının olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Daha az DNA hasarına sahip spermatozoa, daha büyük bir DNA halo boyutuyla ilişkilidir, oysa parçalanmış ve hasar görmüş DNA seviyelerinin arttığı spermatozoalarda ya küçük haleler vardı ya da hiç yoktu. Böylece halosperm, IVF13 ile embriyo kalitesinin ve başarılı gebeliğin potansiyel prognostik belirteci olarak kullanılabilir. Bu örnek, bu tekniğin potansiyel klinik uygulamalarını vurgulamaktadır. Çalışmamızda, genom davranışındaki değişiklikleri ve erken yaşlanma hastalığı Hutchinson-Gilford Progeria Sendromu’nda (HGPS) spesifik ilaç tedavilerinin etkisini değerlendirmek için HALO-FISH’i kullandık15.
Bunlar ve diğer çalışmalar birlikte, DNA halo tekniğinin tekniğin incelenmesi ve faydası için kullanılabileceği süreçlerin / uygulamaların genişliğini vurgulamaktadır.
DNA halo yöntemi, nükleoiskelet ve genom arasındaki etkileşimleri analiz ederken mükemmel bir seçim yöntemidir, ancak uyulması gereken bazı kritik adımlar da vardır. En önemli parametrelerden biri, hücre tohumlama yoğunluğunun optimizasyonudur. Hücreler aşırı birleşirse, DNA haleleri komşu hücrelerle üst üste binecek ve bu da analizin yapılmasını imkansız hale getirecektir. CSK ve ekstraksiyon tamponları, biyolojik aktivitelerini korumak için hazırlama işleminin sonunda ekstraksiyon tamponuna spermin, spermidin ve digitonin eklenerek kullanım gününde her zaman taze yapılmalıdır. Halo-FISH yapıyorsanız, probun veya boyanın daha sonra hibritleşmesini sağlamak için DNA halelerinin doğru denatürasyon sıcaklığını kullanmak son derece önemlidir.
Elektron mikroskobu, nükleer matrisi görselleştirmek için kullanılmıştır, filamentli yapılar tanımlanmıştır20. Bununla birlikte, elektron mikroskobu sınırlıdır, çünkü kromatin ile matris ilişkileri kolayca çıkarılamaz. Gerçekten de, DNA Halo yöntemi, elektron mikroskobu ile karşılaştırıldığında daha çok yönlüdür, çünkü spesifik genler, kromozomlar ve hücre durumları incelenebilir. Ayrıca, nükleer matriks proteinlerinin proteomik analizi incelenmektedir21,22. Bu yöntem, özellikle hastalıklı hücreleri karşılaştırırken, nükleer matris bileşenlerini karşılaştırmak için iyidir, ancak standart DNA Halo tekniği tarafından vurgulanan uzamsal dağılımı ve ekleri sağlamaz.
DNA Halo tahlillerinin sınırlamaları vardır. İlk olarak, matris çıkarılırken, bu sadece sabit hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir, bu nedenle canlı görüntüleme mümkün değildir. DNA Halo yönteminin gerçekleştirilmesi nispeten hızlı ve kolay olmasına rağmen, hücre kültürü, prob üretimi, Halo-FISH ve analiz dikkate alındığında genel süreç zaman alıcı olabilir.
Süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak DNA Haloları ve HALO-FISH’in görüntü yakalaması, DNA’ya özgü probların ve antikorların çözünürlüğünü büyük ölçüde artıracaktır. Ek olarak, florokromlar spektral olarak daha kolay çözülebildiğinden, tek bir deneyde bir dizi DNA probu kullanmak mümkün olabilir ve bu da daha fazla bilgi sağlar. Kromozom konformasyon yakalama (3C) gibi moleküler biyoloji tekniklerindeki gelişmeler, gen lokuslarının etkileşimlerini belirlemek ve hücredeki kromatin üzerindeki mekansal organizasyonu analiz etmek için kullanılmıştır. DNA Halo testleri ve 3C, M3C23 olarak bilinen bir terim olan birleştirilebilir ve yine DNA Halo tekniğinin uyarlanabilirliğini gösterir.
Burada sunulan orijinal veriler, genom davranış sorgulaması olanaklarını ve bu verilerin nasıl sunulacağını göstermektir. Bu verilerle, (1) kromozom boyama probları kullanarak genom bağlanmasında önemli farklılıklar belirlemenin mümkün olduğunu gösterdik, bu çalışmada kromozom 18’in analiz edilenlerden en az bağlı kromozom olduğunu ortaya koyduk (Şekil 3); (2) İki gen lokusu arasında önemli farklılıklar gösteren gen lokusları ve (Şekil 4) (3) Telomerler, çoğalan ve yaşlanan hücrelere kıyasla sessiz hücrelere daha az güçlü bir şekilde bağlanırlar (Şekil 5). Proliferasyon yapan ve olmayan hücreler arasında, çözünmez bir protein olan ve bu nedenle artık çekirdeklerle birlikte kalan proliferasyon belirteci Ki67 antijeninin varlığı veya belirli bir zaman periyodu içinde S-fazından geçen hücreleri vurgulamak için nükleotidlerin dahil edilmesi yoluyla ayrım yapabiliyoruz (Şekil 2). Bu teknik aynı zamanda nükleoiskeletlerinde, yani laminopati hücrelerinde tehlikeye giren hücrelerdeki genom davranışını analiz etmemizi sağlamıştır ve burada ve Bikkul ve ark., 2018’de, genomun kontrol hücrelerine kıyasla daha az sıkı bir şekilde bağlanabileceğini ve klasik HGPS hücrelerinde lamin A mutasyonunun etkisini iyileştiren spesifik ilaçlarla tedavi edilirken restore edilebileceğini ortaya koymaktadır15. Bununla birlikte, burada lamin A mutasyonundan yoksun olan, ancak kromozom 13’ün daha az sıkı bir şekilde bağlandığı LINC kompleks proteini SUN119’un alışılmadık bir formunu içeren atipik HGPS AGO8466 hücreleri için yeni veriler gösteriyoruz (Şekil 6).
HALO-FISH, ekstraksiyon prosedüründen çıkarılmayan proteinleri çözmek için dolaylı immünofloresan ile kombinasyon halinde nükleoiskelet ile genomik etkileşimlerin incelenmesini sağlayan benzersiz bir yöntemdir. Nükleoiskeletin bazı kanser tipleri19 gibi çeşitli hastalıklarda modifiye olduğu ve bazı nükleoiskeletle ilişkili proteinlerin tanısal biyobelirteçler olarak öneminin24,25 olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu teknik, nükleoiskeletin 15,24,25,27 hastalığında kromatin organizasyonu / düzensizliği üzerindeki etkisini incelemede önemli bir role sahiptir ve insan hücreleri ile sınırlı değildir, diğer hayvanlardan kromozomal boyama probları ile aynı DNA-halo protokolü kullanılabilir 28.
The authors have nothing to disclose.
Prof. Michael Bittner’e kromozom kol boyama problarının nazik hediyesi için teşekkür ederiz. LG, AB tarafından finanse edilen EURO-Laminopatiler projesi ve Brunel Progeria Araştırma Fonu tarafından desteklendi.
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |