Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM2,5-induziertenDNA-Schäden in Zebrafisch-Embryoherzen
Summary
Dieses Protokoll verwendet einen Immunfluoreszenz-Assay, um PM2,5-induzierteDNA-Schäden in den sezierten Herzen von Zebrafischembryonen nachzuweisen.
Abstract
Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM2,5)in der Umgebung kann zu einer kardialen Entwicklungstoxizität führen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch unklar. 8-Hydroxy-2′-Desoxygenase (8-OHdG) ist ein Marker für oxidative DNA-Schäden und γH2AX ist ein empfindlicher Marker für DNA-Doppelstrangbrüche. In dieser Studie wollten wir PM2,5-induzierte8-OHdG- und γH2AX-Veränderungen im Herzen von Zebrafischembryonen mit einem Immunfluoreszenz-Assay nachweisen. Zebrafischembryonen wurden mit extrahierbaren organischen Fasern (EOM) aus PM2,5 bei 5 μg/ml in Gegenwart oder Abwesenheit von antioxidativem N-Acetyl-L-Cystein (NAC, 0,25 μM) nach 2 h nach der Befruchtung (hpf) behandelt. DMSO wurde als Fahrzeugsteuerung eingesetzt. Bei 72 HPF wurden Herzen mit einer Spritzennadel aus Embryonen seziert und fixiert und permeabilisiert. Nach der Blockierung wurden die Proben mit primären Antikörpern gegen 8-OHdG und γH2AX untersucht. Die Proben wurden dann gewaschen und mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die resultierenden Bilder wurden unter Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und mit ImageJ quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass EOM aus PM2,5 die 8-OHdG- und γH2AX-Signale im Herzen von Zebrafischembryonen signifikant verbesserte. NAC, das als reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) -Fänger fungierte, wirkte jedoch dem EOM-induzierten DNA-Schaden teilweise entgegen. Hier stellen wir ein Immunfluoreszenzprotokoll zur Untersuchung der Rolle von DNA-Schäden bei PM2,5-induziertenHerzfehlern vor, das zum Nachweis von umweltchemisch induzierten Proteinexpressionsveränderungen in den Herzen von Zebrafischembryonen angewendet werden kann.
Introduction
Luftverschmutzung ist heute ein ernstes Umweltproblem, mit dem die Welt konfrontiert ist. Feinstaub (PM2.5),einer der wichtigsten Indikatoren für die Luftqualität, kann eine große Anzahl von Schadstoffen enthalten und in den Blutkreislauf gelangen, was die menschliche Gesundheit ernsthaft schädigt1. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine PM2.5-Exposition zu einem erhöhten Risiko für angeborene Herzfehler (KHK) führen kann2,3. Beweise aus Tierversuchen zeigten auch, dass PM2,5 eine abnormale Herzentwicklung bei Zebrafischembryonen und den Nachkommen von Mäusen verursachenkann,aber die molekularen Mechanismen der kardialen Entwicklungstoxizität von PM2,5 sind noch weitgehend unbekannt4,5,6.
DNA-Schäden können zu einem Stillstand des Zellzyklus führen und apoptose induzieren, was das Potenzial von Vorläuferzellen weitgehend zerstören und folglich die Herzentwicklung beeinträchtigen kann7). Es ist gut dokumentiert, dass Umweltschadstoffe, einschließlich PM2,5,das Potenzial haben, DNA durch oxidative Stressmechanismen anzugreifen8,9. Sowohl die herzische Entwicklung des Menschen als auch des Zebrafisches reagiert empfindlich auf oxidativen Stress10,11,12. 8-OHdG ist ein oxidativer DNA-Schadensmarker, und das γH2AX-Signal ist ein Marker für DNA-Doppelstrangbrüche. N-Acetyl-L-Cystein (NAC), ein synthetischer Vorläufer von intrazellulärem Cystein und Glutathion, wird häufig als antioxidative Verbindung verwendet. In dieser Studie verwenden wir NAC, um die Rolle von oxidativem Stress bei PM2,5– induzierten DNA-Schäden13zu untersuchen.
Zebrafisch als Modellwirbeltier wurde häufig verwendet, um die Herzentwicklung und menschliche Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen, da Mechanismen der Herzentwicklung bei Wirbeltieren hoch konserviert sind14,15. Zu den Vorteilen der Verwendung von Zebrafischen als Modell gehören ihre geringe Größe, ihre starke Fortpflanzungsfähigkeit und ihre niedrigen Fütterungskosten. Von besonderem Interesse für diese Studien sind Zebrafischembryonen, die während der frühen Entwicklung nicht vom Kreislaufsystem abhängig sind und schwere Herzfehlbildungen überleben können14. Darüber hinaus ermöglicht ihre Transparenz die direkte Beobachtung des gesamten Körpers unter dem Mikroskop. Somit bieten Zebrafischembryonen eine hervorragende Gelegenheit, die molekularen Mechanismen zu bewerten, die an der Induktion der kardialen Entwicklungstoxizität infolge der Exposition gegenüber verschiedenen Umweltchemikalien beteiligt sind5,16,17. Wir haben bereits berichtet, dass PM2,5-induzierteroxidativer Stress zu DNA-Schäden und Apoptose führt, was zu Herzfehlbildungen bei Zebrafischen führt18. In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung von PM2,5-induziertenDNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen zur Verfügung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl Zebrafische ein ausgezeichnetes Wirbeltiermodell für die Untersuchung der kardialen Entwicklungstoxizität von Umweltchemikalien sind, ist es aufgrund der geringen Größe des Embryoherzes schwierig, genügend Protein für die Western-Blot-Analyse zu erhalten. Daher präsentieren wir eine empfindliche Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung der Proteinexpressionsniveaus von DNA-Schadensbiomarkern in den Herzen von Zebrafischembryonen, die PM2,5ausgesetzt sind.
Während d…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Nature Sciences Foundation of China (Förderkennzeichen: 81870239, 81741005, 81972999) und The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions unterstützt.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
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