Estimación del contenido de celulosa cristalina de biomasa vegetal utilizando el método Updegraff

Summary

El método Updegraff es el método más utilizado para la estimación de celulosa. El objetivo principal de esta demostración es proporcionar un protocolo detallado de Updegraff para la estimación del contenido de celulosa en muestras de biomasa vegetal.

Abstract

La celulosa es el polímero más abundante de la Tierra generado por la fotosíntesis y el principal componente portador de carga de las paredes celulares. La pared celular desempeña un papel significativo en el crecimiento y desarrollo de la planta al proporcionar fuerza, rigidez, tasa y dirección del crecimiento celular, mantenimiento de la forma celular, y la protección contra factores de estrés bióticos y abióticos. La pared celular se compone principalmente de celulosa, lignina, hemicellulosa y pectina. Recientemente, las paredes de las células vegetales han sido objeto de la producción de biocombustibles y bioenergía de segunda generación. Específicamente, el componente de celulosa de la pared celular de la planta se utiliza para la producción de etanol celulósico. La estimación del contenido de celulosa de la biomasa es fundamental para la investigación fundamental y aplicada de la pared celular. El método Updegraff es simple, robusto y el método más utilizado para la estimación del contenido cristalino de celulosa de la biomasa vegetal. La fracción de pared celular cruda insoluble en alcohol tras el tratamiento con reactivo Updegraff elimina las fracciones de hemicellulosa y lignina. Más tarde, la fracción de celulosa resistente a reactivos Updegraff se somete a un tratamiento con ácido sulfúrico para hidrolizador del homopolímero de celulosa en unidades monómeros de glucosa. Una línea de regresión se desarrolla utilizando varias concentraciones de glucosa y se utiliza para estimar la cantidad de glucosa liberada sobre la hidrólisis de celulosa en las muestras experimentales. Por último, el contenido de celulosa se estima en función de la cantidad de monómeros de glucosa mediante ensayo de antronétesis colorimétrica.

Introduction

La celulosa es el componente principal de carga de las paredes celulares, que está presente en las paredes celulares primarias y secundarias. La pared celular es una matriz extracelular que rodea las células vegetales y está compuesta principalmente de celulosa, lignina, hemicellulosa, pectina y proteínas matriciales. Aproximadamente un tercio de la biomasa de las plantas es celulosa¹ y desempeña un papel importante en el crecimiento y desarrollo de la planta al proporcionar fuerza, rigidez, tasa y dirección del crecimiento celular, mantenimiento de la forma celular, y la protección contra factores de estrés bióticos y abióticos. La fibra de algodón contiene 95% de celulosa² contenido, mientras que los árboles contienen 40% a 50% de celulosa dependiendo de las especies vegetales y los tipos de órganos^3. La celulosa se compone de unidades repetidas de celobiosa, un disacárido de residuos de glucosa conectados por β-1,4 enlaces glicosidos^4. El etanol celulósico se produce a partir de la glucosa derivada de la celulosa presente en las paredes celulares de la planta^5. La fibra celulósica se compone de varias micro fibrillas en las que cada micro fibril actúa como unidad central con monómeros de glucosa 500-15000^1,6. El homopolímero de celulosa se sintetiza mediante complejos de celulosa sintasa incrustados por membrana plasmática (CSC)^1,7. Las proteínas de celulosa individual sintasa A (CESA) sintetizan cadenas de glucano y las cadenas de glucano adyacentes están conectadas por enlaces de hidrógeno para formar celulosa cristalina^1,8. La celulosa existe en varias formas cristalinas con dos formas predominantes, la celulosa Iα y la celulosa Iβ como formas nativas^9. En plantas superiores, la celulosa existe en forma de celulosa Iβ mientras que la celulosa vegetal inferior existe en Iα forma^10,11. En general, la celulosa desempeña un papel importante en la impartición de fuerza y rigidez a las paredes de las células vegetales.

Los biocombustibles de primera generación se producen principalmente a partir de almidón de maíz, azúcares de caña y azúcares de remolacha, que son fuentes de alimentos, mientras que los biocombustibles de segunda generación se centran en la producción de biocombustibles a partir del material celular de biomasa de plantas no alimentarias^12. La estimación precisa del contenido de celulosa cristalina no sólo es importante para la investigación fundamental sobre la biosíntesis de celulosa y la dinámica de la pared celular, sino también para la investigación aplicada de biocombustibles y bioproductos. Varios métodos han sido desarrollados y optimizados para la estimación de la celulosa en la biomasa vegetal, y el método Updegraff es el método más utilizado para la estimación de celulosa. El primer método notificado para la estimación de celulosa fue por Cross y Bevan en 1908^13. El método se basó en el principio de cloración y extracción alternativa por sulfato de sodio. Sin embargo, la celulosa obtenida por el método original, así como modificado de Cross y Bevan, mostró contaminación de pequeñas fracciones de lignina, además de una cantidad sustancial de xylans y mannans^14. A pesar de varias modificaciones para eliminar la lignina y hemicellulosa de la fracción de celulosa, el método Cross-Bevan retuvo una cantidad considerable de mannans junto con celulosa. Más tarde, el método de Kurschner fue desarrollado mediante el empleo de ácido nítrico y etanol para extraer celulosa¹⁵. Este método indicó que se eliminaron el total de lignina y el 75% de los pentosanos, pero los verdaderos resultados de celulosa fueron los mismos que los estimados por el método de cloración de Cross y Bevan. Otro método (Norman y Jenkins) fue desarrollado mediante el empleo de metanol-benceno, sulfato de sodio, e hipoclorito de sodio para extraer celulosa¹⁶. Este método también retuvo alguna fracción de lignina (3%) y cantidades significativas de pentosanos que conducen a una estimación precisa de la celulosa. Más tarde, Kiesel y Semiganowsky utilizaron un enfoque diferente para hidrolizar la celulosa utilizando ácido sulfúrico concentrado al 80%, y los azúcares reducidos hidrolizados fueron estimados por el método¹⁷de Bertrand. Los dos métodos, Waksman’s y Stevens¹⁸ y Salo^14,19 que fueron desarrollados sobre la base del método de Kiesel y Semiganowsky, también produjeron un 4-5% menos de contenido de celulosa en comparación con los métodos anteriores^20.

El método Updegraff es el método más utilizado para la estimación del contenido de celulosa cristalina. Este método fue descrito por primera vez por Updegraff para la medición de celulosa en 1969²¹. El método Updegraff integra el método Kurschner (uso de ácido nítrico), métodos Kiesel y Seminowsky (hidrólisis de celulosa en monómeros de glucosa utilizando ácido sulfúrico) con algunas modificaciones, y el ensayo de antronosis de Viles y Silverman para una estimación colorimétrica simple de glucosa y contenido de celulosa cristalina^22. El principio de este método es el uso de ácido acético y ácido nítrico (reactivo updegraff) para eliminar la hemicellulosa y la lignina de los tejidos vegetales homogeneizados, que deja celulosa resistente a ácido acético/nítrico para su posterior procesamiento y estimación^15. La celulosa resistente a los ácidos acéticos/nítricos se trata con un 67% de ácido sulfúrico para romper la celulosa en monómeros de glucosa y los monómeros de glucosa liberados se estiman mediante ensayo de antronidad^21,23. Se utilizaron varias modificaciones del método Updegraff original para simplificar el procedimiento y la estimación de celulosa mediante ensayo de antronérona²⁴. En términos generales, este método se puede dividir en cinco fases. En la primera fase, se prepara el material vegetal. En la segunda fase, la pared de células brutas está separada de la biomasa total, ya que la celulosa es el componente clave de las paredes celulares de las plantas. Más tarde, en la tercera fase, la celulosa se separa de los componentes de la pared celular no celulósica mediante el tratamiento con reactivo Updegraff. En la cuarta fase, la celulosa resistente al ácido acético/nítrico se divide en monómeros de glucosa mediante el tratamiento con ácido sulfúrico. El tratamiento con ácido sulfúrico de la celulosa da lugar a la formación de compuestos 5-hidroximetilfurfurales a partir de la reacción de monómeros de glucosa con ácido sulfúrico. Finalmente, en la última fase, la antrone genera un complejo azul verdoso hirviendo con el compuesto furfural generado en la fase anterior^25. Este método colorimétrico basado en antrones fue utilizado por primera vez en 1942 por Dreywood. La antronétesis es un tinte que identifica compuestos furfurales de productos deshidratados de pentosa y hexose como 5-hidroximetilfurfurfural, en condiciones ácidas. La reacción con hexasa produce un color intenso y una mejor respuesta en comparación con las pentoses^25. La cantidad de glucosa encuadernada se mide mediante absorbancia de espectrofotómetro a 620 nm y la intensidad del complejo azul verdoso es directamente proporcional a la cantidad de azúcar en la muestra. Los valores de absorbancia medidos se compararon con una línea de regresión de curva estándar de glucosa para calcular la concentración de glucosa de la muestra. El contenido medido de glucosa se utilizó para estimar el contenido de celulosa de la biomasa vegetal.

Protocol

1. Preparación experimental Moler el material vegetal seco en un polvo fino. Buffer de solubilización de proteínas (PSB): Preparar soluciones de stock de 1 M Tris (pH 8.8), ácido etilenodiaminetetraacetic de 0,5 M (EDTA) (pH 8.0) y autoclavarlos. Haga un amortiguador PSB fresco a partir de estas soluciones de stock con concentraciones finales de Tris de 50 mM, 0,5 mM EDTA y 10% de sulfato de dodecilo sódico (SDS) en agua estéril. Preparar 100 ml de etanol del 70% (v/v): 70 ml de etanol…

Representative Results

Las plantas de algodón cultivadas en la casa verde fueron seleccionadas para este estudio. Se seleccionaron dos líneas experimentales diferentes de algodón para el análisis comparativo del contenido de celulosa. Para cada línea experimental, el tejido radicular se recogió de tres réplicas biológicas. Un total de 500 mg de tejido fue homogeneizado y 20 mg de él se utilizó para la extracción de pared de células crudas. Más tarde, 5 mg de extracto de pared celular cruda se utilizó para el tratamiento reactivo …

Discussion

Las fibras de algodón son fibras naturales producidas a partir de la semilla de algodón. La fibra de algodón es una sola célula con ~95% contenido de celulosa² con alto contenido de celulosa cristalina con amplias aplicaciones en la industria textil^31. Como, fibra de algodón contiene ~ 95% celulosa, hemos utilizado tejidos de raíz de algodón para la demostración de la estimación del contenido de celulosa cristalina. Los tejidos de raíz de algodón son moderadament…

Materials

Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol