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Medizin

Avaliação em tempo real da microperfusão da medula espinhal em um modelo suíno de isquemia/reperfusão

Published: December 10, 2020
doi:
10.3791/62047
, , , , , , , , , , ,
1Department of Anesthesiology, Center of Anesthesiology and Intensive Care Medicine,University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2University Department for Vascular Surgery and Department of Operative Medicine,Medical University of Innsbruck, 3Department of Medical Biometry and Epidemiology,University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Vascular Medicine,University Heart and Vascular Center Hamburg (UHZ), 5Department of Cardiology,Rostock University Medical Center, 6University Department for Cardiac Surgery,Heart Center Leipzig

Summary

A microcirculação da medula espinhal desempenha um papel fundamental na lesão medular. A maioria dos métodos não permite a avaliação em tempo real da microcirculação da medula espinhal, essencial para o desenvolvimento de terapias voltadas à microcirculação. Aqui, propomos um protocolo usando sondas Laser-Doppler-Flow Needle em um grande modelo animal de isquemia/reperfusão.

Abstract

Lesão medular é uma complicação devastadora do reparo aórtico. Apesar dos desenvolvimentos para a prevenção e tratamento da lesão medular, sua incidência ainda é consideravelmente alta e, portanto, influencia o desfecho do paciente. A microcirculação desempenha um papel fundamental na perfusão tecidual e no fornecimento de oxigênio e muitas vezes é dissociada da macrohemodinâmica. Assim, a avaliação direta da microcirculação da medula espinhal é essencial para o desenvolvimento de terapias voltadas à microcirculação e para a avaliação das abordagens existentes em relação à microcirculação da medula espinhal. No entanto, a maioria dos métodos não fornece avaliação em tempo real da microcirculação da medula espinhal. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padronizado para avaliação microcirculatória da medula espinhal em tempo real utilizando sondas de agulha laser-Doppler diretamente inseridas na medula espinhal. Utilizamos um modelo suíno de isquemia/reperfusão para induzir a deterioração da microcirculação da medula espinhal. Além disso, foi utilizada uma técnica de injeção de microesfera fluorescente. Inicialmente, os animais eram anestesiados e mecanicamente ventilados. Posteriormente, foi realizada a inserção da sonda de agulha laser-Doppler, seguida pela colocação da drenagem de fluidos cerebrospinais. Foi realizada uma esternotomia mediana para exposição da aorta descendente para realização de fixação cruzada aórtica. A isquemia/reperfusão foi induzida por fixação transversal aórtica supra-celíaca por um total de 48 min, seguida de reperfusão e estabilização hemodinâmica. O fluxo laser-doppler foi realizado em paralelo com a avaliação macrohemodinâmica. Além disso, a drenagem automatizada de fluidos cerebrospinais foi utilizada para manter uma pressão cefalorraquidiana estável. Após a conclusão do protocolo, os animais foram sacrificados, e a medula espinhal foi colhida para análise histopatológica e microesfera. O protocolo revela a viabilidade das medidas de microperfusão da medula espinhal usando sondas laser-Doppler e mostra uma diminuição acentuada durante a isquemia, bem como a recuperação após a reperfusão. Os resultados mostraram comportamento comparável à avaliação da microesfera fluorescente. Em conclusão, este novo protocolo pode fornecer um modelo animal grande útil para estudos futuros usando avaliação de microperfusão da medula espinhal em tempo real em condições de isquemia/reperfusão.

Introduction

Lesão medular induzida por isquemia/reperfusão (SCI) é uma das complicações mais devastadoras da reparação aórtica associada ao resultado reduzido1,2,3,4. As opções atuais de prevenção e tratamento para SCI incluem a otimização dos parâmetros macrohemodinâmicos, bem como a normalização da pressão do fluido cefalorraquidiano (CSP) para melhorar a pressão de perfusão da medula espinhal2,5,6,7,8,9. Apesar da implementação dessas manobras, a incidência de SCI ainda varia entre 2% e 31%, dependendo da complexidade do reparo aórtico10,11,12.

Recentemente, a microcirculação ganhou maior atenção13,14. A microcirculação é a área de captação de oxigênio celular e troca metabólica e, portanto, desempenha um papel crítico na função do órgão e na integridade celular13. O fluxo sanguíneo microcirculatório prejudicado é um dos principais determinantes da isquemia tecidual associada ao aumento da mortalidade15,16,17,18,19. O comprometimento da microcirculação da medula espinhal está associado à redução da função neurológica e ao desfecho20,21,22,23. Portanto, a otimização da microperfusão para o tratamento de SCI é uma abordagem mais promissora. A persistência de distúrbios microcirculatórios, apesar da otimização macrocirculatória, foi descrita26,27,28,29. Essa perda de coerência hemodinâmica ocorre frequentemente em várias condições, incluindo isquemia/reperfusão, enfatizando a necessidade de avaliação microcirculatória direta e terapias direcionadas à microcirculação26,27,30.

Até agora, poucos estudos utilizaram sondas laser-Doppler para avaliação em tempo real do comportamento microcirculatório da medulaespinhal 20,31. Estudos existentes têm frequentemente utilizado técnicas de injeção de microesfera, que são limitadas pelo uso intermitente e pela análise pós-morte32,33. O número de diferentes medidas usando a técnica de injeção de microesfera é limitado pela disponibilidade de microesferas com diferentes comprimentos de onda. Além disso, em contraste com as técnicas laser-doppler, a avaliação em tempo real da microperfusão não é possível, uma vez que o processamento e análise de tecido pós-mortem é necessário para este método. Aqui, apresentamos um protocolo experimental para avaliação em tempo real da microcirculação da medula espinhal em um modelo animal suíno de isquemia/reperfusão.

Este estudo fez parte de um grande projeto animal que combina um estudo randomizado comparando a influência de crystalloids vs. coloides na microcirculação na isquemia/reperfusão, bem como um estudo exploratório randomizado sobre os efeitos dos fluidos versus vasopressores na microperfusão da medula espinhal. A calibração de 2 pontos da sonda de fluxo, bem como a calibração do cateter de ponta de pressão, foram descritas anteriormente34. Além do protocolo relatado, foram utilizadas microesferas fluorescentes para a medição da microperfusão da medula espinhal, conforme descrito anteriormente, utilizando-se 12 amostras de tecido medular para cada animal, com amostras 1-6 representando a medula espinhal superior e 7-12 representando a medula espinhal inferior35,36. A injeção de microesfera foi realizada para cada etapa de medição após a conclusão das gravações de Laser-Doppler e avaliação macrohemodinâmica. A avaliação histopatológica foi realizada utilizando-se o Kleinman-Score como descrito anteriormente37.

Protocol

O estudo foi aprovado pela Comissão Governamental de Cuidado e Uso de Animais do Município de Hamburgo (Referência-nº 60/17). Os animais receberam cuidados em conformidade com o ‘Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório’ (publicação NIH nº 86-23, revisado 2011), bem como recomendações e experimentos da FELASA foram realizados de acordo com as diretrizes do ARRIVE24,25. Este estudo foi um ensaio agudo, e todos os animais foram eutanizados no final…

Representative Results

Todos os seis animais sobreviveram até a conclusão do protocolo. O peso animal foi de 48,2 ± 2,9 kg; cinco animais eram machos, e um animal era fêmea. A inserção da sonda da agulha da medula espinhal, bem como a medição do fluxo da medula espinhal, foram viáveis em todos os animais. Exemplos de gravações microcirculatórias da medula espinhal em tempo real em combinação com gravações microcirculatórias e macrohem…

Discussion

A CZL induzida pela isquemia da medula espinhal é uma complicação maior do reparo aórtico com tremendo impacto no desfecho do paciente1,2,3,4,10,11,12. As terapias direcionadas à microcirculação para prevenir e tratar o SCI são as mais promissoras. O protocolo fornece um método repr…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Lena Brix, V.M.D, Instituto de Pesquisa Animal, Hannover Medical School, bem como à Sra. Jutta Dammann, Facility of Research Animal Care, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Alemanha, por fornecer cuidados animais pré e perioperatórios e sua assistência técnica no manejo animal. Os autores gostariam ainda de agradecer ao Dr. Daniel Manzoni, Do Departamento de Cirurgia Vascular, Hôpital Kirchberg, Luxemburgo, por sua assistência técnica.

Materials

CardioMed Flowmeter Medistim AS, Oslo, Norway CM4000 Flowmeter for Flow-Probe Femoral Artery
CardioMed Flow-Probe, 5mm Medistim AS, Oslo, Norway PS100051 Flow-Probe Femoral Artery
COnfidence probe,  Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA MA16PAU Flow-Probe Aorta
16 mm liners
DIVA Sevoflurane Vapor Dräger Medical, Lübeck, Germany Vapor
Hotline Level 1 Fluid Warmer Smiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, Germany HL-90-DE-230 Fluid Warmer
Infinity Delta Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Monitoring Hardware
Infinity Hemo Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Pressure Monitoring and Pulmonary Thermodilution Hardware
LabChart Pro ADInstruments Ltd., Oxford, UK v8.1.16 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Software
LiquoGuard 7 Möller Medical GmbH, Fulda, Germany Cerebrospinal Fluid Drainage System
Millar Micro-Tip Pressure Catheter (5F, Single, Curved, 120cm, PU/WD) ADInstruments Ltd., Oxford, UK SPR-350 Pressure-Tip Catheter Aorta
moor VMS LDF moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Hardware
moor VMS Research Software moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Software
Perivascular Flow Module Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA TS 420 Flow-Module for Flow-Probe Aorta
PiCCO 2, Science Version Getinge AB, Göteborg, Sweden v. 6.0 Blood Pressure and Transcardiopulmonary Monitoring Hard- and Software
PiCCO 5 Fr. 20cm Getinge AB, Göteborg, Sweden Thermistor-tipped Arterial Line 
PowerLab ADInstruments Ltd., Oxford, UK PL 3516 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Hardware
QuadBridgeAmp ADInstruments Ltd., Oxford, UK FE 224 Four Channel Bridge Amplifier for Laser-Doppler and Invasive Blood Pressure Aquisition
Silverline Spiegelberg, Hamburg, Germany ELD33.010.02 Cerebrospinal Fluid Drainage
SPSS statistical software package  IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USA v. 27 Statistical Software
Twinwarm Warming System Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 12TW921DE Warming System
Universal II Warming Blanket Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 906 Warming Blanket
VP 3 Probe, 8mm length (individually manufactured) moor Instruments, Devon, UK Laser-Doppler Probe
Zeus Dräger Medical, Lübeck, Germany Anesthesia Machine
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Behem, C. R., Friedheim, T., Wipper, S. H., Pinnschmidt, H. O., Graessler, M. F., Gaeth, C., Holthusen, H., Rapp, A., Suntrop, T., Haunschild, J., Etz, C. D., Trepte, C. J. C. Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion. J. Vis. Exp. (166), e62047, doi:10.3791/62047 (2020).
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