Entdeckung metastasierender Regulatoren mit einem schnellen und quantitativen intravitalen Chick Chorioallantoic Membrane Model
Summary
Dies ist eine effektive Methode, um nach Suppressoren oder Treibern von Krebsmetastasen zu suchen. Zellen, die mit einer Expressionsbibliothek transduziert werden, werden in das Gefäßsystem der Chorioallanto-Membran des Huhns injiziert, um metastatische Kolonien zu bilden. Kolonien mit verminderter oder erhöhter Invasivität werden herausgeschnitten, erweitert, neu injektiert, um ihren Phänotyp zu bestätigen, und schließlich mit Hochdurchsatzsequenzierung analysiert.
Abstract
Jüngste Fortschritte in der Krebsforschung haben die hochkomplexe Natur der Krebsmetastasierung veranschaulicht. Es wurde festgestellt, dass mehrere Gene oder Gennetzwerke an der differentiell regulierenden Krebsmetastasat von Kaskadengenen und Genprodukten beteiligt sind, die von der Krebsart, dem Gewebe und den individuellen Patientenmerkmalen abhängen. Diese stellen potenziell wichtige Ziele für genetische Therapeutika und ansätze der personalisierten Medizin dar. Die Entwicklung von Schnellscreening-Plattformen ist für die Identifizierung dieser genetischen Ziele unerlässlich.
Die Chorioallantoic Membrane (CAM) ist eine stark vaskularisierte, kollagenreiche Membran unter der Eierschale, die den Gasaustausch im sich entwickelnden Embryo ermöglicht. Aufgrund der Lage und Vaskularisierung des CAM haben wir es als intravitaselles menschliches Krebsmetastasierungsmodell entwickelt, das eine robuste Xenotransplantation menschlicher Krebszellen und echtzeitfähige Bildgebung von Krebszellinteraktionen mit der kollagenreichen Matrix und dem Gefäßsystem ermöglicht.
Mit diesem Modell wurde eine quantitative Screening-Plattform zur Identifizierung neuartiger Treiber oder Suppressoren von Krebsmetastasen entwickelt. Wir transduzierten einen Pool von Kopf-Hals-HEp3-Krebszellen mit einer vollständigen shRNA-Genbibliothek des menschlichen Genoms und injizierten die Zellen dann mit geringer Dichte in das CAM-Gefäßsystem. Die Zellen vermehrten sich und bildeten Einzeltumorzellkolonien. Einzelne Kolonien, die nicht in das CAM-Gewebe eindringen konnten, wurden als kompakter Koloniephänotyp sichtbar und zur Identifizierung der in den Zellen vorhandenen transduzierten shRNA herausgeschnitten. Bilder einzelner Kolonien wurden auf ihre Invasivität untersucht. Mehrere Auswahlrunden wurden durchgeführt, um die Rate der Falschalarme zu senken. Einzelne, isolierte Krebszellklone oder neu entwickelte Klone, die Gene von Interesse exprimieren, wurden einem primären Tumorbildungstest oder einer Kooptionsanalyse der Krebszellengefäße unterzogen. Zusammenfassend stellen wir eine schnelle Screening-Plattform vor, die eine antimetastasierte Zielidentifikation und intravitasale Analyse einer dynamischen und komplexen Kaskade von Ereignissen ermöglicht.
Introduction
Metastasierung ist die Hauptursache für den Tod von Krebspatienten1,2,3. Metastasierte Krebszellen nutzen unterschiedliche Signalwege, abhängig von der Art des Krebses, während der fünf Schritte der metastasierten Kaskade: lokale Invasion, Intravasation, Überleben im Kreislauf, Extravasation und Kolonieexpansion an entfernten metastatischen Stellen. Das aktuelle Verständnis dieses metastasierten Prozesses legt nahe, dass es zwei Engpassschritte gibt, einer ist die gerichtete Invasion der Krebszelle aus dem Primärtumor und der zweite ist die Etablierung der metastasierten Läsion an der entfernten Stelle4,5,6. Beide Schritte erfordern, dass Krebszellen aktiv mit Kollagen und Vaskulatur an den Stellen der anfänglichen Invasion oder der Bildung von fernen metastasierten Läsionen interagieren. Daher müssen metastasierende Krebszellen in der Lage sein, sich an Zellen zu binden, Kollagenfasern umzugestalten und direkt entlang der Gefäßwände einzudringen7. Screening-Modelle, die schnell antimetostatische therapeutische Ziele identifizieren können, um Krebszellen daran zu hindern, diese Schritte abzuschließen, sind von größter Bedeutung. Bestehende In-vitro-Screening-Modelle ahmen die komplexe Lebendgewebeumgebung nicht vollständig nach. Mausmodelle sind teuer und zeitaufwendig. Daher besteht ein dringender Bedarf an intravitalen Screening-Plattformen, die komplexe Lebendgewebeumgebungen und eine schnelle Identifizierung von Zielen ermöglichen.
In den letzten zehn Jahren hat sich der Hühnerembryo als robustes und kostengünstiges Modell der menschlichen Krebsmetastasierung etabliert8,9,10,11,12. Das Chischorioallantoic Membrane (CAM) Gewebe ist dünn und durchscheinend, was es ideal für die intravitale mikroskopische Bildgebung von Zell- und Kolonieverhalten in Primärtumoren und / oder metastasierten Stellenmacht 12. Das primäre Tumorwachstum aus mehreren menschlichen Krebszelllinien kann innerhalb von nur wenigen Tagen nach der Mikroinjektion in das CAM-Gewebe initiiert und metastasiert werden. Krebszellen können auf verschiedene Arten in das CAM-Gewebe verabreicht werden, einschließlich intravenös, intra-CAM oder als Kollagen auf Pflanzen, diese Flexibilität ermöglicht es dem Forscher, sich auf bestimmte Stadien der Krebsprogression zu konzentrieren, zum Beispiel metastatische Läsionsbildung, Invasion aus dem Primärtumor oder Angiogenese.
Hier beschreiben wir eine quantitative Screening-Plattform, mit der die Fähigkeit von Krebszellen gemessen werden kann, invasive metastatische Läsionen zu etablieren. Krebszellen, die mit einer Expressionsbibliothek transduziert wurden, werden intravenös in das CAM-Gefäßsystem mit geringer Dichte injiziert. Metastasierte Kolonien bilden sich für 4-5 Tage, dann wird die Invasionsfähigkeit und Vaskulaturinteraktion der resultierenden Kolonien bewertet. Einzelne Kolonien, die nicht eindringen, werden herausgeschnitten, vermehrt und ihr Phänotyp wird im CAM durch Reinjektion und Quantifizierung der Koloniekompaktheit und der Kontakt zwischen Krebszelle und Blutgefäßen bestätigt. Die Expressionsbibliothekskonstrukte, die für den einzelnen metastasierten Koloniemutantenphänotyp verantwortlich sind, werden aus isolierter koloniegenomischer DNA mittels Hochdurchsatzsequenzierung identifiziert. Die gleiche Plattform kann weiter verwendet werden, um den kausalen Zusammenhang zwischen einem Gen und dem beobachteten Phänotyp zu validieren oder um eingehende mechanistische Studien am beobachteten Phänotyp durchzuführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein auf schneller Fluoreszenzmikroskopie basierendes intravitales Screening-Protokoll, das für wichtige Anwendungen wie genetische oder Arzneimittelkandidaten-Screens verwendet werden kann. Krebszellen, die mit einer genetischen Bibliothek von Interesse transduziert oder mit einzelnen Expressionskonstrukten transfiziert wurden, können mit diesem Chick CAM-Modell schnell gescreent und auf den interessierenden Phänotyp quantifiziert werden. Da Transduktions- oder Transfektionsprotokolle je nach Bibl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 an JDL und KS unterstützt. Dr. Lewis ist Inhaber des Frank und Carla Sojonky Lehrstuhls für Prostatakrebsforschung, der von der Alberta Cancer Foundation unterstützt wird.
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
Referenzen
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