ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析
Summary
哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。
Abstract
哺乳類の脳の適切な発達は、神経幹細胞増殖と異なる神経細胞タイプへの分化の細かいバランスに依存しています。このバランスは、転写、転写後、翻訳など、複数のレベルで微調整された遺伝子発現によって厳しく制御されます。この点で、証拠の成長体は、神経幹細胞の運命決定を調整する際の翻訳調節の重要な役割を強調しています。ポリサム分画は、グローバルおよび個々の遺伝子レベルの両方でmRNA翻訳状態を評価するための強力なツールです。ここでは、開発中のマウス大脳皮質からの細胞の翻訳効率を評価するための社内ポリソームプロファイリングパイプラインを提示する。我々は、sucrose勾配調製、組織ライシス、超遠心分離及び分画ベースのmRNA翻訳状態の分析のためのプロトコルを記述する。
Introduction
哺乳類の脳の発達の間に、神経幹細胞は増殖し、分化してニューロンとグリア1、2を生成する。このプロセスの摂動は、脳の構造と機能の変化につながることができます, 多くの神経発達障害に見られるように3,4.神経幹細胞の適切な行動は、特定の遺伝子5の調整された発現を必要とする。これらの遺伝子のエピジェネティックおよび転写制御は鋭意的に研究されているが、最近の知見は、他のレベルでの遺伝子調節が、神経幹細胞増殖と分化6、7、8、9、10の協調にも寄与することを示唆している。このように、翻訳制御プログラムに取り組むことは、神経幹細胞の運命決定と脳の発達の根底にあるメカニズムの理解を大きく進める。
リボソームプロファイリング、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)およびポリソームプロファイリングを含むmRNAの翻訳状態を評価するために、異なる強みを有する3つの主要な技術が広く適用されている。リボソームプロファイリングはRNAシーケンシングを使用してリボソームで保護されたmRNA断片を決定し、各転写物の翻訳リボソームの数と位置をグローバルに分析し、転写量11と比較して間接的に翻訳速度を推測することを可能にする。TRAPはエピトープタグ付きリボソームタンパク質を利用してリボソーム結合mRNA12を捕捉する。タグ付きリボソームタンパク質が遺伝的アプローチを用いて特定の細胞型で発現できることを考えると、TRAPは細胞型特異的な方法で翻訳を分析することを可能にする。これに対して、ポリソームプロファイリングは、ショ糖密度勾配分画を使用して、自由で翻訳不良な部分(軽いモノソーム)をリボソーム(重いポリソーム)によって積極的に翻訳されているものから分離し、mRNA13上のリボソーム密度を直接測定する。この技術が提供する1つの利点は、ゲノム全体の翻訳法解析14と同様に、関心のある特定のmRNAの翻訳を研究するための汎用性である。
本論文では、開発中のマウス大脳皮質を分析するためのポリソームプロファイリングの詳細なプロトコルについて述べている。私たちは、ショ糖密度勾配を準備し、下流のアプリケーションの分数を収集するために、ホームアセンブルシステムを使用しています。ここで提示されるプロトコルは、他のタイプの組織および生物を分析するために容易に適応することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ポリサムプロファイリングは、単一遺伝子およびゲノムワイドレベル14 の両方で翻訳状態を評価する一般的かつ強力な技術である。本レポートでは、開発中のマウス皮質を分析するための、ホームアセンブルプラットフォームとそのアプリケーションを用いたポリソームプロファイリングのプロトコルを紹介する。この費用対効果の高いプラットフォームは、堅牢で再現性?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NSERCディスカバリーグラント(RGPIN/04246-2018からG.Y.)によって資金提供されました。G.Y.はカナダ研究委員長です。S.K.は、ミタックス・グローバリンク大学院フェローシップとACHRI大学院生奨学金によって資金提供されました。
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
Referenzen
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