プリンデキストラン硫酸ナトリウムによる大腸炎モデルにおける腸内炎症の系統的採点解析
Summary
無料のコンピュータ支援システムを用いた腸内炎症の系統的採点は、潰瘍および炎症性変化の存在を特徴とする大腸炎モデルにおける組織病理学的変化を定量的に比較する強力なツールである。組織学的大腸炎スコア評価は臨床観察を強化し、データ解釈を促進する。
Abstract
マウス大腸炎モデルは、炎症性腸疾患の病態生物学を理解することに焦点を当てた研究で広く採用されているツールです。.しかし、疾患重症度の客観的かつ再現可能な定量化のための堅牢な基準は、依然として定義されている。大腸炎分析法の多くは、腸管の小さなセグメントの限られた組織学的スコアリングに依存し、部分的または偏った分析につながる。ここでは、大腸全体の高解像度画像取得と縦断分析を組み合わせて、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発型マウス大腸炎の腸内損傷および潰瘍を定量化する。このプロトコルは、広範なユーザーの訓練なしで客観的で再現可能な結果の生成を可能にします。ここでは、DSS誘導大腸炎のデータ例を用いて、サンプル調製と画像解析に関する包括的な詳細を提供します。この方法は、粘膜損傷に関連する重大な炎症を有するマウス大腸炎の他のモデルに容易に適応することができる。我々は、結腸の全長に対する炎症/負傷および浸食/潰瘍化された粘膜の割合が、DSS誘発疾患の進行の中での体重減少などの臨床所見と密接に類似していることを示す。この組織学的プロトコルは、DSS大腸炎実験において、疾患活動の分析を公平に標準化するための、信頼できる時間と費用対効果の高い援助を提供します。
Introduction
消化管上皮バリアは、下層の組織区画1から発光抗原および病原体を分離する上で極めて重要な役割を果たす。炎症性腸疾患(IBD)、虚血、または外科的傷害などの病理学的状態で見られる上皮損傷および粘膜創傷は、下痢、体重減少、便中の血液、および腹痛を含む臨床症状に関連している。傷害に対して、上皮細胞は粘膜バリア欠陥を再上皮化および修復するために移動し、増殖する。炎症の解決と粘膜完全性の払戻は、腸粘膜恒常性および機能2、3、4を再確立するために極めて重要である。
腸上皮バリアの損傷に関連する基礎的な分子メカニズムを研究するために、様々な動物モデルが採用されています。化学的に誘発された大腸炎の確立された、容易に適用可能なモデルは、特にIBDのような炎症性傷害に関連する研究において広く使用されている。一般的な、再現性、信頼性の高いマウス大腸炎モデルは、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)媒介大腸損傷および炎症を採用しています。疾患の重症度は、マウス株、DSSの用量、DSS投与の長さ、およびDSS5、6、7の分子量によって異なる。
DSS大腸炎中の腸粘膜損傷は、通常、体重減少、便血量、および便の一貫性によって決定される複合スコアである疾患活性指数(DAI)を用いて評価される。便の血液量は、微視的(便グアイアック酸試験を使用して検出)または巨視的であり得る。便の一貫性は、硬、軟、または液体(すなわち、下痢)5、8に分類される。これらの臨床パラメータのスコア付けは主観的であり、ユーザーの経験やバイアスによって異なる可能性がありますが、全体的にはデータが信頼できる情報を提供し、IBDの研究者によって広く使用されています。対照的に、粘膜損傷の組織学的評価のための一般的に受け入れられている方法はない。最も一般的には、結腸の選択された領域は、訓練を受けた病理学者によって検査され、通常、脊髄損傷および白血球浸潤9、10、11を含むいくつかのパラメータに基づいて採点される。しかし、調査対象のパラメータの数と分析した組織の量は個々の報告によってかなり異なるため、多くの公表された研究の比較可能性は限られている。観察者の偏見を減らし、研究間のコンコーダンスを強化するために、理想的な組織学的スコアリングプロトコルは、腸粘膜の炎症が最も頻繁に可変であり、スキップ病変が一般的であるため、結腸の全長を含むべきである、2)特定のキーに限定分析し、主観性を低下させるために容易に解釈可能なパラメータ、3)多数のサンプルの高速で一貫した処理を容易にし、4)広く利用可能で手頃な価格のツールを使用してデータを取得し、4)広く利用可能で手頃な価格のツールを使用する。
ここでは、小腸の結腸全体または長いセグメントを「スイスロール」構成で処理する技術と、DSS誘発性大腸炎による腸粘膜炎症および損傷を分析するための無料のコンピュータ支援スコアリングシステムの使用について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの組織学的大腸炎スコアシステムは、腸の組織の炎症や損傷を定量化するための信頼性の高いツールを構成します。このアプローチは、小さな領域や不完全なセクションを選択するバイアスなしで、器官全体の組織病理学的状態の理解を改善します。このプロトコルを正常に実行するための重要なステップの中には、コロンの長さの少なくとも90%の分析を可能にするスイスロールの適?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、NIHの資金調達DK055679、DK089763、DK079392、DK061739、DK072564およびミシガン大学病理学スライドスキャンサービスからの支援を認めたい。
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
Referenzen
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
