Isolamento e imagem de lapso de tempo das células mesenquima palatinas embrionárias do camundongo primário para analisar atributos de movimento coletivo
Summary
Apresentamos um protocolo de isolamento e cultura de células mesenquimais palatinas embrionárias primárias para imagens de lapso de tempo de crescimento bidimensional (2D) e ensaios de reparação de feridas. Também fornecemos a metodologia para análise dos dados de imagem de lapso de tempo para determinar a formação de fluxo celular e a motilidade direcional.
Abstract
O desenvolvimento do paladar é um processo dinâmico, que envolve o crescimento vertical das prateleiras palatais bilaterais ao lado da língua seguidas de elevação e fusão acima da língua. Defeitos nesse processo levam à fissura palatina, um defeito comum de nascimento. Estudos recentes têm demonstrado que a elevação da prateleira palatal envolve um processo de remodelação que transforma a orientação da prateleira de uma vertical para uma horizontal. O papel das células mesenquimais da prateleira palatal nesta remodelagem dinâmica tem sido difícil de estudar. A análise quantitativa baseada em imagens de lapso de tempo foi recentemente usada para mostrar que as células mesenquimais palatinas embrionárias primárias do camundongo (MEPM) podem se auto-organizar em um movimento coletivo. Análises quantitativas poderiam identificar diferenças nas células mutantes mepm de um modelo de rato com defeitos de elevação do paladar. Este artigo descreve métodos para isolar e cultivar células MEPM de embriões E13.5 – especificamente para imagens de lapso de tempo – e determinar vários atributos celulares do movimento coletivo, incluindo medidas para formação de fluxo, alinhamento de forma e persistência de direção. Ele afirma que as células MEPM podem servir como um modelo proxy para estudar o papel do mesenquime de prateleira palatal durante o processo dinâmico de elevação. Esses métodos quantitativos permitirão aos pesquisadores do campo craniofacial avaliar e comparar atributos de movimento coletivo no controle e células mutantes, o que aumentará a compreensão da remodelagem mesenquimal durante a elevação da prateleira palatal. Além disso, as células MEPM fornecem um raro modelo de célula mesenquimal para investigação do movimento celular coletivo em geral.
Introduction
O desenvolvimento palaciano tem sido estudado extensivamente como defeitos na palatogênese levam à fissura palatina – um defeito de nascimento comum que ocorre em casos isolados ou como parte de centenas de síndromes1,2. O desenvolvimento do paladar embrionário é um processo dinâmico que envolve movimento e fusão de tecido embrionário. Este processo pode ser dividido em quatro etapas principais: 1) indução de prateleiras palatais, 2) crescimento vertical das prateleiras palatais ao lado da língua, 3) elevação das prateleiras palatais acima da língua, e 4) fusão das prateleiras palatais na linha média1,3,4. Ao longo das últimas décadas, muitos mutantes de camundongos foram identificados que manifestam fissura palatina5,6,7,8. A caracterização desses modelos indicou defeitos na indução da prateleira palatal, na proliferação e nas etapas de fusão; no entanto, defeitos de elevação da prateleira palatal têm sido raros. Assim, compreender a dinâmica da elevação da prateleira palatal é uma área intrigante de pesquisa.
A análise cuidadosa de alguns mutantes de camundongos com defeitos de elevação da prateleira palatal levou ao modelo atual mostrando que a região anterior da prateleira palatal parece virar para cima, enquanto um movimento vertical para horizontal ou “remodelagem” das prateleiras palatais ocorre nas regiões médias e posteriores do paladar1,3,4, 9,10,11. O epitélio de borda medial da prateleira palatal provavelmente inicia a sinalização necessária para esta remodelagem, que é então impulsionada pela mesenquime da prateleira palatal. Recentemente, muitos pesquisadores identificaram atraso na elevação da prateleira palatal em modelos de camundongos que mostraram aderências orais transitórias envolvendo prateleiras palatais12,13. A remodelagem mesenquimal envolve a reorganização das células para criar uma protuberância na direção horizontal, ao mesmo tempo em que retrai simultaneamente a prateleira palatal na direção vertical9,10,14. Entre os vários mecanismos propostos para afetar a elevação da prateleira palatal e a remodelagem mesenquimal subjacente estão a proliferação celular15,16,17, gradientes quimotacticos18e componentes da matriz extracelular19,20. Uma pergunta importante surgiu: o atraso de elevação da prateleira palatal é observado em camundongos deficientes specc1ltambém em parte devido a um defeito na remodelação da prateleira palatal, e esse defeito de remodelação poderia se manifestar em um defeito intrínseco no comportamento das células primárias do MEPM21?
Células mepm primárias têm sido utilizadas no campo craniofacial para muitos estudos envolvendo expressão genética22,23,24,25,26,27,28,29, e alguns envolvendo proliferação30,31 e migração25,31,32 , mas nenhum para análise de comportamento celular coletivo. A imagem de lapso de tempo das células MEPM foi realizada em estudos de cultura 2D e reparação de feridas para mostrar que as células MEPM apresentavam movimento direcional e formavam fluxos celulares dependentes da densidade do movimento coletivo21. Além disso, as células mutantes Specc1l formaram fluxos celulares mais estreitos e apresentaram trajetórias de migração celular altamente variáveis. Essa falta de motilidade coordenada é considerada para contribuir para o atraso de elevação do paladar nos embriões mutantes Specc1l 13,21. Assim, esses ensaios relativamente simples usando células MEPM primárias podem servir como um proxy para estudar a remodelagem mesenquimal durante a elevação da prateleira palatal. Este artigo descreve o isolamento e a cultura das células mepm primárias, bem como a imagem e análise de lapso de tempo, para os ensaios 2D e reparação de feridas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A elevação da prateleira palatal constitui um evento de remodelação vertical para horizontal1,3,4,9,11. É postulado que este processo de remodelação requer que as células mesenquimais de prateleira palatal se comportem coordenadamente. As análises com células MEPM do tipo selvagem mostram que esse comportamento celular é intrínseco e pode ser quant…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde de bolsas DE026172 (IS) e GM102801 (A.C.). O I.S. também foi apoiado em parte pelo Centro de Excelência em Pesquisa Biomédica (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) e Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
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