Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern derselben Spezies zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen
Summary
Hier beschreibt das Protokoll, wie man eine doppelte Markierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von primären Antikörpern durchführt, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Es kann auch den dritten Antikörper von einem anderen Wirt in diesem Protokoll enthalten. Dieser Ansatz kann in jedem Zelltyp und Pathogen durchgeführt werden.
Abstract
Heutzutage ist es möglich, eine breite Palette von molekularen Werkzeugen zu finden, um Parasiten-Wirts-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Es bestehen jedoch einige Einschränkungen, um kommerzielle monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erhalten, die spezifische Zellstrukturen und Proteine in Parasiten erkennen. Außerdem gibt es nur wenige kommerzielle Antikörper zur Kennzeichnung von Trypanosomatiden. Normalerweise werden polyklonale Antikörper gegen Parasiten im eigenen Haus hergestellt und könnten in Kombination mit anderen Antikörpern, die in derselben Spezies produziert werden, schwieriger zu verwenden sein. Hier zeigt das Protokoll, wie polyklonale und monoklonale Antikörper, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, verwendet werden, um eine Doppeltemarkierung der Immunfluoreszenz durchzuführen, um wirtszell- und pathogeninteraktionen zu untersuchen. Um die doppelmarkierende Immunfluoreszenz zu erreichen, ist es entscheidend, zuerst den polyklonalen Antikörper der Maus zu inkubieren und dann die Inkubation mit dem sekundären Maus-IgG-Antikörper zu verfolgen, der mit einem beliebigen Fluorochrom konjugiert ist. Danach ist ein zusätzlicher Blockierungsschritt notwendig, um zu verhindern, dass spuren des primären Antikörpers vom nächsten sekundären Antikörper erkannt werden. Dann werden ein monoklonaler Maus-Antikörper und sein spezifischer sekundärer IgG-Unterklasse-Antikörper, der an ein anderes Fluorochrom konjugiert ist, zu den geeigneten Zeitpunkten in die Probe gegeben. Darüber hinaus ist es möglich, eine dreifache Markierung der Immunfluoreszenz mit einem dritten Antikörper durchzuführen, der in einer anderen Spezies aufgezogen wurde. Auch Strukturen wie Kerne und Aktin können anschließend mit ihren spezifischen Verbindungen oder Markierungen gefärbt werden. Somit können diese hier vorgestellten Ansätze für jede Zelle angepasst werden, deren Primärantikörperquellen begrenzt sind.
Introduction
Die Untersuchung der Interaktion des Erregers mit der Wirtszelle auf zellulärer Ebene liefert wesentliche Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Krankheit, da verschiedene Gruppen wie Viren, Bakterien und Protozoen die meisten Wirtszelltypen infizieren können1,2,3,4. Es kann auch dazu beitragen, potenzielle therapeutische Ziele zu entwickeln und zu identifizieren, die das Wachstum des Erregers verlangsamen oder hemmen können. Unter Lebensbedingungen sind die produzierten Antikörper für die Erkennung von Selbstkomponenten, Antigenen von Viren, bakteriellen Komponenten oder Produkten, Pilzen, Parasiten und anderen verantwortlich5.
Zu diesem Zweck sind Antikörper weit verbreitete Werkzeuge, hauptsächlich zum Verständnis der Lage und Funktion zellulärer Strukturen und Proteine. Mehrere Studien mit multipler Antikörpermarkierung zeigen, dass zusätzliche Blockierungsschritte zur Spezifität der Immunlokalisierung beitragen. Darüber hinaus verwenden die meisten beschriebenen Protokolle spezifische kommerzielle monoklonale Antikörper, einschließlich Antikörper von derselben Wirtsspezies6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Normalerweise verwendet die Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz zwei Antikörper, die in verschiedenen Spezies aufgezogen werden, um die Zellstrukturen von Interesse oder die Krankheitserreger und die Wirtszellen zu färben, um die Interaktion zwischen ihnen zu sehen. Dies kann jedoch ein Problem sein, wenn keine kommerziellen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper speziell für einige Krankheitserreger zur Verfügung stehen, um die Doppelmarkierung durchzuführen. Außerdem gibt es kommerziell erhältliche Antikörperkonjugationskits, und es ist möglich, die primären Antikörper durch eine Succinimidylesterreaktion direkt an das Fluorophor zu konjugieren15. Das Problem ist, dass diese Kits oft teuer sind und es notwendig ist, genügend Antikörper zu haben, um sie zu markieren. Mit diesem Wissen haben wir erfolgreich eine doppelte Immunfluoreszenzmethode entwickelt, bei der zwei verschiedene Antikörper verwendet werden, die in derselben Spezies gezüchtet wurden, um die Proteinlokalisation in Trypanosoma brucei16 zu untersuchen. Für intrazelluläre Parasiten, einschließlich Trypanosoma cruzi, wurde dieser Ansatz jedoch nicht nachgewiesen. Hier zeigen wir, wie man eine Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz durchführt, um intrazelluläre T. cruzi-Parasiten und die Wirtszelle mit primären Antikörpern zu untersuchen, die in derselben Spezies ohne Kreuzreaktionen aufgezogen wurden. Neben dieser Methode wurde eine dreifache Immunfluoreszenzmarkierung unter Zugabe des dritten Antikörpers einer anderen Spezies etabliert. Diese Ansätze helfen, wenn die Quelle von Antikörpern begrenzt ist und kann in jedem Zelltyp verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung einer doppelten Immunmarkierung in mit Trypanosoma cruzi infizierten Zellen mit zwei verschiedenen Antikörpern derselben Wirtsspezies vor. Um die Auswirkungen der Infektion genauer zu untersuchen, können Strukturen in der Wirtszelle wie der Zellkern oder zytosolische Organellen mit diesem Protokoll markiert werden. Es kann auch in der Post-Embedding-Dünnschnitt-Immunogold-Markierungsmethode verwendet werden. Dieser Ansatz hilft, das Hindernis zu überwinden, nu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) an MMAB, von Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA zu MMAB und von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – Finanzcode 001. CG-C erhielt ein Master- und Promotionsstipendium von CAPES und LAMT-S erhielt ein Promotionsstipendium von CNPq. Wir danken Elizabete R. Milani für die konfokale Mikroskopie-Unterstützung und Dr. Dario Zamboni für die Bereitstellung von LLC-MK2-Zellen (Ribeirao Preto Medical School, USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
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