Os protocolos apresentados podem ser usados para caracterizar a resposta de microbolhas fluorescentes rotuladas projetadas para aplicações de entrega de medicamentos acionados por ultrassom, incluindo seus mecanismos de ativação, bem como seus efeitos biológicos. Este artigo abrange uma gama de técnicas de microscopia in vitro e in vivo realizadas para capturar o comprimento e escalas de tempo relevantes.
Os agentes de contraste de microbolhas têm grande promessa para aplicações de entrega de medicamentos com ultrassom. Encapsular drogas em nanopartículas reduz a toxicidade sistêmica e aumenta o tempo de circulação das drogas. Em uma nova abordagem para a entrega de medicamentos assistidos por microbolhas, as nanopartículas são incorporadas em ou em conchas de microbolhas, permitindo a liberação local e desencadeada da carga de nanopartículas com ultrassom. Uma compreensão completa dos mecanismos de liberação dentro do vasto espaço de parâmetros de ultrassom é crucial para uma liberação eficiente e controlada. Este conjunto de protocolos apresentados é aplicável a microbolhas com uma concha contendo um rótulo fluorescente. Aqui, o foco está em microbolhas carregadas com nanopartículas poli (2-2-ethyl-butil cyanoacrilato), dopadas com um corante vermelho do Nilo modificado. As partículas são fixadas dentro de uma concha desnaturada. As microbolhas são produzidas por agitação vigorosa, formando uma dispersão de gás perfluoropropano na fase líquida contendo caseína e nanopartículas, após a qual a concha de microbolhas se auto-monta. Uma variedade de técnicas de microscopia são necessárias para caracterizar os microbolhas estabilizados por nanopartículas em todas as escalas de tempo relevantes do processo de liberação de nanopartículas. A fluorescência das nanopartículas permite imagens confocal de microbolhas únicas, revelando a distribuição de partículas dentro da concha. Imagens in vitro de ultra-alta velocidade usando microscopia de campo brilhante a 10 milhões de quadros por segundo fornecem insights sobre a dinâmica da bolha em resposta à inssonação do ultrassom. Finalmente, a liberação de nanopartículas da casca de bolha é melhor visualizada por meio de microscopia de fluorescência, realizada a 500.000 quadros por segundo. Para caracterizar a entrega de medicamentos in vivo, a liberação desencadeada de nanopartículas dentro da vasculatura e sua extravasação além da camada endotelial é estudada utilizando microscopia intravital em tumores implantados em câmaras de janelas de dobra dorsal, ao longo de uma escala de tempo de vários minutos. A combinação dessas técnicas complementares de caracterização fornece uma visão única sobre o comportamento dos microbolhas e sua liberação de carga em uma variedade de escalas de tempo e comprimento, tanto in vitro quanto in vivo.
O ultrassom é a técnica de imagem médica mais utilizada. É não invasivo, rápido, seguro, econômico e portátil1,2,3. No entanto, o sangue é um dispersão de ultrassom ruim, e o contraste da poça sanguínea pode ser aumentado por uma injeção intravenosa de agentes de contraste de ultrassom3. Esse contraste aprimorado da poça sanguínea permite a quantificação da perfusão de órgãos para fins diagnósticos, por exemplo, na detecção de doença arterial coronariana4 e doença hepática metastática5. De fato, a vasculatura tumoral foi provada como um importante fator prognóstico6. Um grande esforço de pesquisa agora é direcionado para microbolhas assistidas, imagens moleculares direcionadas e agentes de contraste de alfaiataria para uso terapêutico.
Os agentes de contraste de ultrassom disponíveis comercialmente normalmente consistem em uma suspensão de microbolhas revestidas7,8 com diâmetros que variam de 1 μm a 10 μm9. Uma vez que os microbolhas do agente de contraste de ultrassom são ligeiramente menores que os glóbulos vermelhos7, os microbolhas podem atingir com segurança até mesmo os menores capilares sem criar uma oclusão3. Os microbolhas têm um coeficiente de backscattering de ultrassom dramaticamente aumentado em comparação com o tecido10, devido ao seu núcleo de gás compressível11. Além disso, o eco de microbolhas é altamente não linear, ou seja, seu espectro contém harmônicos e subharmônicos da frequência de condução. Além disso, a força do eco depende fortemente da resposta ressonante da bolha12. Enquanto o tecido se dispersa apenas linearmente, um pequeno número de microbolhas é suficiente para alcançar uma alta sensibilidade de detecção em imagens harmônicas13,14. Esta geração de contraste não linear pode até ser forte o suficiente para rastrear bolhas únicas no corpo15.
A concha do agente de contraste do ultrassom estabiliza as bolhas contra a dissolução e a coalescência, aumentando assim seu tempo de circulação na poça sanguínea16. A casca pode consistir de lipídios, polímeros ou proteínas desnaturadas3,8. Diminui a tensão interfacial, limitando assim o efeito da dissolução movida a pressão de Laplace17 e cria uma barreira resistiva contra a difusão de gás18. Para aumentar ainda mais a estabilidade, os microbolhas de contraste são tipicamente preenchidos com um gás de alto peso molecular com baixa solubilidade no sangue11. A concha de microbolhas altera drasticamente a resposta dos microbolhas à inseção de ultrassom11. Bolhas de gás não revestidas têm uma frequência de ressonância característica que é inversamente proporcional ao seu tamanho e a adição de um revestimento lipídico aumenta a frequência de ressonância em relação à de um buble não revestido devido à rigidez intrínseca da casca3. Além disso, a casca dissipa energia através da viscosidade dilatacional, que constitui a fonte dominante de amortecimento para bolhas revestidas3. A concha estabilizadora tem a vantagem adicional de que pode ser funcionalizada, por exemplo, ligando ligantes de destino à superfície de microbolhas. Esse direcionamento permite muitas aplicações para essas bolhas e, em particular, imagens moleculares com ultrassom14,19.
Os agentes de contraste de microbolhas têm grande promessa para aplicações de entrega de medicamentos com ultrassom. Microbolhas oscilando no confinamento de um vaso sanguíneo podem causar microstreaming, bem como tensões normais e de tesoura locais na parede capilar3. Em altas pressões acústicas, grandes oscilações de amplitude podem levar ao colapso de microbolhas em um processo violento chamado cavitação inercial, que, por sua vez, pode levar à ruptura ou invaginação do vaso sanguíneo20. Esses fenômenos violentos podem induzir efeitos bioefálicos como a sonopermeação21, aumentando a extravasão de drogas terapêuticas no interstício através da parede endotelial, seja paracelularmente ou transcelularmente. Também pode melhorar a penetração de agentes terapêuticos através da matriz extracelular de tumores ricos em estroma21,22 e biofilmes23,24, embora esse mecanismo ainda seja mal compreendido26.
O fornecimento de medicamentos mediados por ultrassom tem mostrado resultados promissores tanto pré-clínicos27,28 quanto em ensaios clínicos22. Além disso, quando usados com ultrassom relativamente de baixa frequência (~1 MHz), microbolhas têm sido relatadas localmente e transitoriamente aumentam a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo assim que as drogas entrem no parenchyma cerebral, tanto em estudos pré-clínicos quanto clínicos29,30,31,32,33,34.
Geralmente há duas abordagens para o fornecimento de medicamentos mediados por ultrassom: o material terapêutico pode ser coadministrado com as bolhas, ou pode ser anexado ou carregado na bolha shell28,35,36. A segunda abordagem mostrou-se mais eficiente em termos de entrega de drogas37. Microbolhas podem ser carregadas com drogas ou material genético encapsulados em nanopartículas (lipossomos ou nanoconstróis poliméricas) anexadas à casca ou incorporadas diretamente na concha de microbolhas35,36. Microbolhas carregadas de nanopartículas podem ser ativadas por ultrassom (focado) para liberar localmente a carga de nanopartículas28,33,38,39,40. Se tal microbolhas estiver em contato direto com uma célula, foi demonstrado in vitro que a carga pode até ser depositada na membrana citoplasmática celular em um processo chamado sonoimplos34,35.
O espaço do parâmetro de ultrassom para insonação de microbolhas é extenso, e as condições biológicas in vivo adicionam ainda mais complexidade. Assim, a combinação de ultrassom focado e microbolhas carregadas de nanopartículas representa um desafio no campo da terapêutica direcionada.
O objetivo deste trabalho é fornecer protocolos que possam ser utilizados para a imagem, em detalhes, a resposta de microbolhas em função dos parâmetros de ultrassom e estudar os mecanismos que levam à ruptura da concha e posterior liberação do material de concha fluorescente. Este conjunto de protocolos é aplicável a microbolhas com conchas que contêm um corante fluorescente. A Figura 1 mostra uma representação esquemática dos microbolhas polimórica-nanopartículas e proteínas estabilizadas desenvolvidas no SINTEF (Trondheim, Noruega). Estas bolhas são preenchidas com gás perfluoropropano (C3F8) e as nanopartículas que estabilizam a casca contêm NR668, que é um derivado lipofílico de corante fluorescente vermelho do Nilo38,43. As nanopartículas consistem em poli (2-ethyl-butyl cyanoacrylate) (PEBCA) e são PEGylated. A funcionalização com polietileno glicol (PEG) reduz a opsonização e a fagocitose pelo sistema de fagocite mononuclear, ampliando assim o tempo de circulação14,44. Como resultado, a PEGylation aumenta a quantidade de nanopartículas atingindo o local alvo, melhorando assim a eficácia do tratamento16. A Figura 2 ilustra como o uso de quatro métodos de microscopia permite que os pesquisadores cubram todas as escalas de tempo e comprimento relevantes. Deve-se notar que a resolução espacial alcançável na microscopia óptica é determinada pelo limite de difração, que depende do comprimento de onda da luz e abertura numérica (NA) do objetivo e da fonte de iluminação do objeto45. Para os sistemas em mãos, o limite de resolução óptica é tipicamente de 200 nm. Além disso, a microscopia intravital pode ser usada para imagem no nível subcelular46. Para os microbolhas estabilizados por nanopartículas e proteínas utilizados neste trabalho, a escala mínima de comprimento relevante para a microscopia intravital é do tamanho de pequenos capilares (≥ 10 μm). Imagens ópticas in vitro de alta velocidade (10 milhões de quadros por segundo) e experimentos de imagens de fluorescência de alta velocidade (500.000 quadros por segundo) são descritos para microbolhas únicas. Imagens de campo brilhante de alta velocidade em escalas de tempo nanossegundos são adequadas para estudar a dinâmica radial resolvida pelo tempo das bolhas vibratórias. Em contraste, a microscopia de fluorescência de alta velocidade permite a visualização direta da liberação das nanopartículas fluorescentes. Além disso, a estrutura da cápsula de microbolhas pode ser investigada usando microscopia confocal tridimensional (3D) de Z-stack (3D) e microscopia eletrônica de varredura (o protocolo para este último não está incluído no trabalho atual). A microscopia intravital consiste em usar microscopia multifotícula para tumores de imagem crescendo em câmaras de janelas dorsais para fornecer informações em tempo real sobre o fluxo sanguíneo local e sobre o destino de nanopartículas fluorescentes rotuladas em vivo47. A combinação desses métodos de microscopia, em última análise, fornece uma visão detalhada do comportamento dos agentes de microbolhas terapêuticas em resposta ao ultrassom, tanto in vitro quanto in vivo.
Diferentes métodos ópticos de microscopia foram combinados para obter informações sobre as várias etapas na entrega de nanopartículas da superfície dos microbolhas para o meio circundante. Foram realizadas imagens das oscilações da bolha, bem como imagens da liberação das nanopartículas da casca de bolha, da extravasação e da penetração através da matriz extracelular dos tumores in vivo. A imagem in vitro permite a triagem de muitos parâmetros de ultrassom em comparação com as configurações in vivo mais complexas. O benefício de combinar essa gama de modalidades de imagem são as informações complementares que podem ser obtidas em diferentes escalas de tempo – característica crucial para caracterizar e otimizar as microbolhas para entrega bem sucedida e para obter eficácia terapêutica. Esta abordagem é útil para entender os mecanismos de entrega de todos os microbolhas, incluindo construções com nanopartículas e drogas fluorescentes.
Os passos mais críticos nos métodos de microscopia utilizados para estudar microbolhas simples são os seguintes. Para microscopia de fluorescência, as nanopartículas devem ser rotuladas fluorescentemente para permitir a visualização da liberação de partículas. Além disso, a solução amostral deve ser diluída o suficiente para isolar microbolhas únicas para análise em métodos de microscopia de confocal, de campo brilhante e fluorescência. Além disso, é importante escolher uma frequência de condução de ultrassom e pressão acústica para excitar as bolhas de forma mais eficiente, ou seja, em sua ressonância. Se a questão da pesquisa diz respeito à entrega da carga de nanopartículas, os parâmetros de ultrassom apropriados devem fazer parte da investigação. Ao lado da ressonância, essas bolhas também devem ser conduzidas a ou além de seu limiar para liberação de nanopartículas, tipicamente em amplitudes de pressão acústica relativamente altas (MI > 0,3)51. Para imagens de microscopia de campo brilhante, é fundamental escolher uma câmera de alta velocidade com uma taxa de quadro suficientemente alta para minimizar o desfoque de movimento e evitar o aliasing.
A microscopia de campo brilhante é limitada principalmente pelo framerate de imagem e intensidade das fontes de luz disponíveis, uma vez que uma taxa de quadros mais alta daria uma visão mais detalhada do tempo resolvido sobre a dinâmica da bolha, mas requer iluminação mais intensa devido a tempos de exposição mais curtos. Para estudar a liberação de partículas com mais detalhes, o framerate para imagens de fluorescência pode, em princípio, ser aumentado aumentando a intensidade da luz laser. No entanto, a absorção da luz laser de alta intensidade pelas microbolhas fluorescentes com rótulos fluorescentes gera calor, mesmo com corantes de alto rendimento quântico. Esse calor pode interferir com os experimentos em jogo e, em casos extremos, induzir cavitação foto-térmica52. Assim, na prática, há um limite para a fluência a laser aplicada. No entanto, a intensa iluminação a laser também pode ser deliberadamente usada para induzir a liberação de partículas de lipossomos53. A temperatura influencia a dinâmica da bolha e a resposta ao ultrassom, dependendo do tipo bolha54. Portanto, se os métodos in vitro e intravital forem comparados objetivamente, os métodos in vitro discutidos no protocolo devem ser realizados a 37 °C. Outra limitação dos métodos in vitro discutidos no artigo atual é que as bolhas não estão em um ambiente de campo livre, pois os microbolhas flutuarão abaixo da membrana do suporte da amostra. Além disso, há um viés de seleção ao fotografar microbolhas únicas. No entanto, a realização de experimentos repetidos em bolhas únicas permite a investigação do efeito do tamanho e remoção do fator de confusão – a distribuição de tamanho. Se a resposta da bolha em função do tamanho puder ser entendida enquanto a concentração não for muito alta para evitar interações bolha-bolha, a resposta de qualquer população de bolhas arbitrárias pode ser calculada. Finalmente, tanto os métodos de microscopia de campo brilhante quanto de fluorescência fornecem insights sobre microbolhas complicadas em uma imagem bidimensional (2D). Se a questão da pesquisa exigir mais de imagens 2D, o comportamento 3D das bolhas pode ser resolvido combinando a configuração descrita no protocolo com uma configuração de visão lateral para imagens multiplanas55.
Um método alternativo para estudar microbolhas é a caracterização acústica56. No entanto, medir o eco de um único microbolhas requer localizar e isolar uma única microbola dentro do feixe de ultrassom56, o que representa um desafio tipicamente enfrentado pelo uso de um tubo estreito ou pinça óptica ou acústica57,58. Para dimensionar bolhas acústicas, os microbolhas podem ser insonificados no regime de dispersão geométrica em frequências muito superiores à sua frequência de ressonância, o que não induz oscilações volumétricas de microbolhas59. O uso de uma “câmera acústica” é um método para imagem da dinâmica radial de microbolhas únicas em resposta ao ultrassom, onde uma sonda de ultrassom de alta frequência é usada para determinar a resposta radial da bolha a uma onda de condução de baixa frequência60. A desvantagem deste método é que ele só pode ser usado para determinar a alteração relativa do raio de microbolhas; portanto, outro método é necessário para determinar o raio de bolha absoluta, por exemplo, através de imagens ópticas61,62. A desvantagem dos métodos em que os microbolhas são expostos ao ultrassom em frequências superiores à sua frequência de ressonância é que, em frequências tão altas, a profundidade de penetração é reduzida59, limitando a usabilidade para aplicações in vivo. Outras formas de microscopia também podem ser usadas para estudar microbolhas como microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de transmissão63. A resolução espátula-temporal alcançável dessas técnicas alternativas de microscopia, no entanto, é geralmente mais limitada, e essas técnicas têm a desvantagem de que a imagem é realizada antes ou depois da exposição ao ultrassom por análise off-line e normalmente apresentam um baixo throughput63. Outra alternativa é usar um método de dispersão de luz, que pode ser usado para estudar a dinâmica radial de microbolhas únicas em tempo real, mas tem uma baixa relação sinal-ruído em comparação com os métodos de dispersão acústica64.
A microscopia intravital em tempo real durante a exposição ao ultrassom é um método poderoso para adquirir uma nova visão sobre a vasculatura, comportamento de microbolhas, nanopartículas ou outras moléculas (como o dextran neste caso) durante a exposição ao ultrassom. Uma limitação geral ao realizar microscopia intravital em tempo real é que apenas uma pequena área do tecido é visualizada, e a profundidade de penetração da luz no tecido é limitada. Se os vasos de imagem contiveram pouquíssimas microbolhas e/ou nanopartículas dentro do campo de visão, pouca ou nenhuma informação sobre o comportamento da nanopartícula e extravasação pode ser obtida. Além disso, devido ao campo de visão limitado, um alinhamento adequado entre os caminhos de luz e ultrassom é crucial. Se a pressão do ultrassom for alta o suficiente para induzir a destruição da bolha, também é importante escolher uma frequência de repetição de pulso que permita que bolhas frescas se reperfusem no campo de visão entre pulsos de ultrassom. Além disso, como o ultrassom será refletido a partir do vidro de cobertura na câmara da janela e do objetivo, colocar o transdutor em um ângulo é importante para reduzir os reflexos, como para evitar a formação de ondas de pé, que distorcem o campo de pressão calibrado. Outra questão prática é que a configuração precisa ter espaço suficiente para montar o transdutor de ultrassom e guia de ondas acima ou abaixo do objetivo na configuração do microscópio. Os tumores na câmara da janela dorsal terão uma espessura limitada devido à câmara de confinamento e ao deslizamento da tampa; no entanto, se necessário, outros modelos poderiam ser usados. Exemplos são tumores de dobras cutâneas, por exemplo, na almofada de gordura mamária 65 ou na imagem intravital abdominal de tumores nos vários órgãos66. Tais tumores podem ser cultivados ortotopicamente no microambiente adequado e, como tal, apresentam um caso mais clinicamente relevante.
Os métodos descritos neste trabalho esclarecem o potencial de microbolhas fluorescentes para estudar os fundamentos das aplicações de entrega de medicamentos utilizando bolhas e ultrassom. Esta combinação de métodos de microscopia fornece uma visão valiosa sobre a resposta de microbolhas à inssonação do ultrassom e seu espaço de parâmetro acústico associado e apresenta uma visão clara do comportamento de microbolhas e cargas ao longo de uma faixa relevante de escalas de tempo e comprimento.
The authors have nothing to disclose.
100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 | Tabor Electronics | Arbitrary waveform generator (programmable) | |
2100 L | ENI | Amplifier, used in window chamber setup | |
2 MDa dextran | Sigma-Aldrich | ||
33522 A | Agilent Technologies | Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup | |
A1R | Nikon Instruments | Confocal microscope | |
ACE I | SCHOTT | Dimmable AC halogen light source | |
Atipemazol | Orion Pharma | Antidote to wake animal | |
Baytril | Bayer | Enrofloxacin | |
BD Neoflon 24 G | Becton Dickinson & Company | Tail vein catheter | |
BNC model 575 | Berkely Nucleonics Corporation | Pulse/delay generator | |
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Branson | Ultrasonic bath | |
Channel slide | Ibidi | ||
CLINIcell 25 | Laboratoires Mabio International | Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm) | |
Cohlibri | Lightline | Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm) | |
DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | Oscilloscope | |
Fentanyl | Actavis Group HF | Anaesthesia of mouse | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | Supplement for cell culture medium | |
Fiber-optic hydrophone | Precision Acoustics | Used for alignment | |
Flumanezil | Fresenius Kabi | Antidote to wake animal | |
Heated animal holder | Custom design | A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber | |
Hyper Vision HPV-X2 | Shimadzu | High-speed camera | |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin | open source image processing program | |
In vivo SliceScope | Scientifica | Multiphoton microscope | |
Isoflurane | Baxter | ||
ISOTON | Beckman Coulter | Filtered, phosphate-buffered saline solution | |
LUMPLFLN60XW | Olympus | Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm) | |
MaiTai DeepSee | Spectra-Physics | Pulsed laser | |
MATLAB | Mathworks | Programming environment | |
Medetomidine | Orion Pharma | Anesthesia of mouse | |
Midazolam | Accord Healthcare Limited | Anesthesia of mouse | |
Milli-Q | Merck | Ultrapure water | |
MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe | PerkinElmer | Strobe light | |
Panametrics-NDT C305 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1") | |
Panametrics-NDT V304 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25") | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
Perfluoropropane gas | F2 Chemicals | ||
Roswell Park Memorial Institute 1640 | Gibco Thermo-Fisher | Cell culture medium | |
Safe-Lock tube | Eppendorf | ||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
T 25 basic ULTRA-TURRAX | IKA laboratory technology | Dispersion tool | |
TDS 210 | Tektronix | Oscilloscope, used in window chamber setup | |
Transducer | Precision Acoustics Ltd | Used in window chamber setup | |
U-TLU | Olympus | Tube lens | |
VBA100-200 | Vectawave | Amplifier | |
Window chambers | Custom made | Used in window chamber setup | |
XLUMPLFLN20 XW | Olympus | 20x water dipping objective | |
XY(Z) translation stages | Thorlabs |