Summary
Escherichia coli ist die Hauptursache für neonatale Gram-negative bakterielle Meningitis. Während der bakteriellen Infektion spielen reaktive Sauerstoffspezies, die von Neutrophilen produziert werden, eine wichtige bakterizide Rolle. Hier führen wir eine Methode zum Nachweis der reaktiven Sauerstoffspezies in Neutrophilen als Reaktion auf Meningitis E. coliein.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) ist die häufigste gramnegative Bakterien verursacht neonatale Meningitis. Das Auftreten von Bakteriämie und bakterielle Penetration durch die Blut - Hirn-Schranke sind unverzichtbare Schritte für die Entwicklung von E. coli Meningitis. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) stellen die wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen dar, um die eingedrungenen Krankheitserreger zu zerstören. In diesem Protokoll wurde die zeitabhängige intrazelluläre ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coli infiziert waren, mit fluoreszierenden ROS-Sonden quantifiziert, die von einem Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroplattenleser nachgewiesen wurden. Diese Methode kann auch auf die Beurteilung der ROS-Produktion in Säugetierzellen während der Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und Wirt angewendet werden.
Introduction
Neonatale bakterielle Meningitis ist eine häufige pädiatrische Infektionskrankheit. Escherichia coli (E. coli) mit einer K1-Kapsel ist der häufigste gramnegative Erreger, der eine neonatale bakterielle Meningitis verursacht und etwa 80% der Gesamtinzidenz1,2,3ausmacht. Trotz der Fortschritte in der antimikrobiellen Chemotherapie und unterstützenden Pflege ist die bakterielle Meningitis immer noch eine der verheerendsten Erkrankungen mit hoher Morbidität und Mortalität4.
Das Auftreten der neonatalen bakteriellen Meningitis beginnt in der Regel mit Bakteriämie, die durch das Eindringen pathogener Bakterien in den peripheren Kreislauf aus den lokalen Läsionen der Neugeborenen verursacht wird, gefolgt von der Penetration durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in das Gehirn, was zu einer Entzündung der Hirnhaut4führt. Der Beginn der Bakteriämie hängt von der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsimmunzellen einschließlich Neutrophilen und Makrophagen usw. ab. Neutrophile, die für 50-70% der weißen Blutkörperchen ausmachen, sind die erste Verteidigungslinie gegen bakterielle Infektionen5,6. Während der Invasion von Bakterien werden die aktivierten Neutrophilen an die infektiösen Stellen rekrutiert und geben reaktive Sauerstoffspezies (ROS) frei, einschließlich des Superoxid-Anions, Wasserstoffperoxids, Hydroxylradikalen und Singlet-Sauerstoff7. Die ROS durchlaufen Redox-Reaktionen mit der Zellmembran, Nukleinsäuremolekülen und Proteinen der Bakterien, was zu Verletzungen und Zum Tod der eindringenden Bakterien8führt. Die Mitochondrien sind der Hauptstandort der ROS-Produktion in eukaryotischen Zellen, und verschiedene Oxidasen (z.B. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH) Oxidase-Komplex, Lipoxygenase-System, Proteinkinase C und Cyclooxygenase-System) vermitteln die Produktion von ROS9,10. Die Echtzeitmessung der Produktion von ROS, die den primären antimikrobiellen Mechanismus in Neutrophilen darstellt, ist eine nützliche Methode, um die Wirtsabwehr während der Bakterien-Wirt-Interaktion zu untersuchen.
In diesem Protokoll wurde die zeitabhängige ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coli infiziert waren, mit einer fluoreszierenden ROS-Sonde DHE quantifiziert, die von einem Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroplattenleser nachgewiesen wurde. Diese Methode kann auch auf die Beurteilung der ROS-Produktion in anderen Säugetierzellen während der Pathogen-Wirt-Interaktion angewendet werden.
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Protocol
Peripheres Blut von Freiwilligen, die in dieser Forschung angewendet wurden, wurde vom Institutional Review Board des ersten Krankenhauses der China Medical University (#2020-2020-237-2) genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien und Kulturmedium
- Bereiten Sie den Lysepuffer der roten Blutkörperchen vor, indem Sie 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 37,2 mg Na2EDTA in 1 L doppelt destilliertes Wasser hinzufügen und den pH-Wert auf 7,2-7,4 einstellen. Entfernen Sie die Bakterien durch Filtration mit 0,22 m Filtern.
- Bereiten Sie experimentelles Kulturmedium für Neutrophile vor, indem Sie 5% fetales Rinderserum zu RPMI 1640 medium hinzufügen und bei 4 °C lagern. Gleichgewicht auf Raumtemperatur vor Gebrauch.
HINWEIS: Verwenden Sie das MEDIUM RPMI 1640 ohne Phenolrot. - Phosphatpuffersalzin (PBS) vorbereiten, indem Sie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO42H2O und 0,2 g KH2PO4 in 1 L doppelt destilliertes Wasser in einen 1 L Glaskolben geben. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4 ein. Autoclave es für 15 min bei 121 °C.
- Bereiten Sie Rifampicin-Lösung durch Auflösen von 0,5 g Rifampicinpulver in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) vor, um eine 50 mg/ml Rifampicin-Lösung zu ergeben.
- Bereiten Sie LB Agar Lösung durch Zugabe von 10 g NaCl, 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 15 g Agarpulver in 1 L doppeldestilliertes Wasser und Autoklav die Mischung. Füllen Sie die Petri-Schalen auf die Hälfte des Volumens, indem Sie warme LB-Agar-Lösung mit 100 g/ml Rifampicin gießen. Die gekühlte Feststoffplatte bei 4 °C aufbewahren.
- Bereiten Sie die Für Bakterienstämme geeignete Hirninfusion (BHI) Brühe vor, indem Sie 37 g BHI-Pulver in 1 L doppelt destilliertes Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein und autoklavieren Sie ihn.
- Lösen Sie die fluoreszierende Sonde Dihydroethidium (DHE) in DMSO Lösungsmittel auf, um eine 10 mM Stofflösung zu erhalten. Vor Gebrauch vorsichtig mischen.
HINWEIS: Aliquot die Lagerlösung sofort in lichtdichte Fläschchen. Die Haltbarkeit der Lagerlösung beträgt 6 Monate bei -20 °C.
2. Herstellung des E44-Bakterienstamms
HINWEIS: E44 ist ein mutierter Stamm von meningitischem E. coli mit Rifampicin-Resistenz.
- Tauchen Sie die kryokonservierte E44-Kolonie mit einer sterilen Pipettenspitze, impfen Sie den E44-Stamm auf die LB-Agarplatte, die 100 g/ml Rifampicin enthält, indem Sie Linien zeichnen. Legen Sie die Platte über Nacht bei 37 °C auf den Kopf in den Inkubator.
- Einen Tag vor dem Experiment eine E44-Kolonie mit einer sterilen Pipettenspitze von der Platte pflücken und in 5 ml BHI-Brühe mit 100 g/ml Rifampicin in einem 50 ml-Kolben geben. Inkubationsshaker die Bakterienkultur bei 37 °C mit 90 Umdrehungen von 17 Stunden inkubieren.
3. Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem peripherem Blut
- Zeichnen Sie 5 ml Blutprobe von Freiwilligen intravenös in das Vakuumblutentnahmeröhrchen mit EDTA zur Antikoagulation.
- Zentrifuge die peripheren Blutproben bei 500 x g für 5 min. Die Blutproben werden durch Zentrifugation in drei Schichten unterteilt, die von unten nach oben die Rote Blutkörperchen (RBC), die weiße Blutkörperchenschicht (WBC) und die Plasmaschicht sequenziell sind.
- Saugen Sie die weiße Blutkörperchenschicht mit einer Pipette auf ein neues Rohr mit 3x RBC-Lysepuffer. Mischen Sie die Mischung gründlich und legen Sie bei Raumtemperatur für 5 min.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand vollständig und entsorgen.
- Wiederholen Sie die Lyse-Prozedur mit RBC-Lysepuffer 1-2 mal, bis der Niederschlag weiß wird.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie den Niederschlag mit 2 ml PBS wieder aufhängen. Dann Zentrifuge bei 300 x g für 5 min, damit sich die Zellen bis zum Boden des Rohres absetzen.
- Beschriften Sie die Neutrophile mit CD16-Mikroperlen, indem Sie das Sediment mit 50 l vorgekühlten magnetischen Zellsortierpuffern aufhängen. Dann mischen Sie mit 50 l menschlichen CD16 Mikroperlen gründlich. Inkubieren Sie die Mischung bei 4 °C für 30 min.
HINWEIS: Lösungen sollten vorgekühlt werden, um eine Deckelung von Antikörpern auf der Zelloberfläche und eine unspezifische Kennzeichnung zu verhindern. Die meisten Erwachsenen haben etwa 4.000 bis 10.000 weiße Blutkörperchen pro Mikroliter Blut, unter denen Neutrophile etwa 50-70% ausmachen. Nach Schätzung sind die Zahlen der gesamten weißen Blutkörperchen in 5 ml des menschlichen peripheren Blutes in der Regel bis zu 2-5 x 107. - Waschen Sie die Zellen, indem Sie 2 ml magnetischen Zellsortierpuffer und Zentrifuge bei 4 °C, 300 x g für 10 min hinzufügen. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie den Niederschlag mit 500 l Sortierpuffer wieder auf.
- Montieren Sie die Magnetsäule und das Trennregal. Verschieben Sie das Trennzeichen mit der magnetischen Spalte in das Regal und spülen Sie die Säule mit 3 ml Sortierpuffer.
- Lassen Sie die Zellsuspension in die Spalte, damit die neutrophilen, die durch die Magnetperlen beschriftet sind, an der Magnetsäule befestigt werden können.
- Waschen Sie die nicht beschrifteten Zellen ab, indem Sie 3 ml magnetischen Zellsortierpuffer 3 Mal hinzufügen, um sicherzustellen, dass das Säulenreservoir jedes Mal leer ist.
- Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetischen Separator und legen Sie sie auf ein 15 ml-Rohr. Fügen Sie der Spalte 5 ml magnetischen Zellsortierpuffer hinzu. Drücken Sie die magnetisch beschrifteten Zellen mit einem Kolben aus.
HINWEIS: Um die Reinheit der Neutrophilen zu verbessern, können die Sortierschritte mit einer neuen Spalte wiederholt werden. - Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml Kulturmedium wieder auf. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Zellzähler und bereiten Sie die Zellen auf weitere Experimente vor.
4. Messung von ROS
- Zentrifugieren Sie die isolierten Neutrophilen bei 300 x g für 5 min, setzen Sie den Niederschlag wieder auf, und stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 106/ml mit Kulturmedium mit einer Fluoreszenzsonde von 5 m DHE ein.
- Inkubieren Sie die Neutrophilen bei 37 °C für 30 min, um die DHE-Sonde zu laden, und weisen Sie die Zellsuspension dann einer 96-well schwarzen Polystyrol-Mikroplatte mit 200 l pro Bohrkörper zu.
- Schalten Sie den Mikroplattenleser ein und öffnen Sie die Erkennungssoftware. Wählen Sie das undurchsichtige 96-Wells-Plattenformat und bestimmen Sie den Lesebereich.
- Stellen Sie die Fluoreszenz (Ex/Em = 518/605 nm) im kinetischen Modus alle 5 min für 60 min bei 37 °C ein. Achten Sie darauf, die Platte für 3 s vor jeder Lesung zu schütteln.
- Nehmen Sie die Mikroplatte aus dem Inkubator, fügen Sie die kultivierten E44 (MOI=100) oder phorbol 12-myristate 13-Acetat (PMA) (100 ng/mL) zu jedem Brunnen enthaltenden vorbelasteten Neutrophilen mit 3 Replikationen hinzu. Verwenden Sie PMA als Positivkontrolle.
- Legen Sie die Platte in den Mikroplattenleser und starten Sie den Test sofort.
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Representative Results
Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll wurden die Neutrophilen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und mit der Fluoreszenzsonde DHE beladen, um die Veränderungen des ROS-Spiegels als Reaktion auf die E44-Infektion zu erkennen. Hier stellen wir repräsentative Daten zur Verfügung, die die ROS-Produktion demonstrieren, die durch den E44-Stamm evoziert wird, der von einem Mikroplattenleser in Echtzeit bestimmt wird. Durch Zugabe von E44-Stämmen bei einem MOI von 100 stiegen die ROS-Werte sofort an und zeigten einen kontinuierlichen Aufwärtstrend mit zeitabhängiger Weise (Abbildung 1). Durch Zugabe von PMA, einem bekannten ROS-Induktor von intrazellulärem ROS in Neutrophilen, beobachteten wir eine S-förmige Kurve, die eine flache Kurve in der Anfangsphase darstellt, gefolgt von einer signifikanten Erhöhung von 20 min auf 40 min und schließlich einem Spitzenwert von 60 min(Abbildung 1).
Abbildung 1. Zeitabhängige ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coliinfiziert sind. Aus menschlichem peripherem Blut isolierte Neutrophile wurden mit DHE-Farbstoff geladen, ein E44-Stamm (MOI=100) wurde hinzugefügt und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde sofort mit einem Mikroplattenleser bestimmt. Neutrophile, die mit PMA (100 ng/ml) behandelt wurden, wurden als positiv erflästigen. Alle Daten wurden auf den Anfangswert normalisiert, um die relative DHE-Intensität zu erhalten, und als Mittelwert ± SEM (n = 3) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Neutrophile fungieren als die am häufigsten vorkommende Komponente der weißen Blutkörperchen in der menschlichen Blutzirkulation. Sie sind wichtige Effektorzellen im angeborenen menschlichen Immunsystem, das die erste Verteidigungslinie gegen die Invasion von Krankheitserregern baut11. Die Erzeugung von ROS stellt einen der wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen nach Phagozytose11dar. Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine netzähnliche Struktur, die von einem Neutrophilen namens Neutrophilen extrazelluläre Falle (NET) freigesetzt wird, auch am Bakterientötungsprozess6,11,12beteiligt ist.
Es wurde berichtet, dass ROS, das durch Neutrophile produziert wird, die durch die Stimulation pathogener Mikroorganismen induziert werden, hauptsächlich durch die Aktivierung der NADPH-Oxidase verursacht wird, die aus zwei Membranbindungsuntereinheiten (gp91phox und p22phox) und drei zytosolischen Untereinheiten (p47phox, p67phoxund p40phox)5besteht. Die verschlungenen Bakterien aktivieren eine Reihe von Kinasen innerhalb der Neutrophilen, wie Proteinkinase C (PKC), Proteinkinase A (PKA) und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK), die die zytosolischen Untereinheiten p47Phox der NADPH-Oxidase phosphorylieren. Dann transloziert ein zytosolierischer Trimmer, bestehend aus p47phox, p67phox, und p40phox auf die Membran, um mit der Membranbindung Untereinheit gp91phox und p22phoxzu kombinieren, die den vollständigen NADPH-Oxidase-Komplex bilden. Der zusammengesetzte NADPH-Oxidase-Komplex überträgt NADPH-abgeleitete Elektronen auf molekularesO2,erzeugt Superoxid-Anionen und aktiviert die bakteriziden Funktionen13,14,15. Es wird auch berichtet, dass ROS von Neutrophilen produziert kann auch mit der NET-Bildung von Neutrophilen16,17verbunden sein. Daher würde der Nachweis der ROS-Produktion zur weiteren Untersuchung des bakteriziden Mechanismus von Neutrophilen beitragen.
In diesem Protokoll werden die aus peripherem Blut isolierten Neutrophilen mit der Fluoreszenzsonde DHE vorbelastet und einer 96-well schwarzen Polystyrol-Mikroplatte zugeordnet. Die ROS-Intensität wird von einem Mikroplattenleser in Echtzeit nach dem Zuführen der meninitischen Escherichia coli nachgewiesen.
Das gesammelte Blut wird mit EDTA oder Citrat antikoaguliert, um die Aktivierung von Neutrophilen durch Komplement18zu vermeiden. Da Neutrophile endlos differenziert sind und eine kurze Lebensdauer (ca. 4-8 Stunden) im zirkulierenden Blut haben, sollten die Isolationsschritte so schnell wie möglich nach der Blutentnahme19durchgeführt werden. Viele isolierende Reagenzien, wie Ficoll-Hypaque und Percoll, wurden verwendet, um Neutrophile aus peripherem Blut zu isolieren11,19,20. In diesem Protokoll werden Neutrophile durch CD16-Mikroperlenauswahl nach Erythrozytenlyse aus dem peripheren Blut isoliert. Es bietet signifikante Verbesserungen in Geschwindigkeit, Einfachheit und Reinheit. Um reinere Neutrophilen zu erhalten, könnte vor der Isolierung mit CD16-Magnetperlen eine Dichtegradientenzentrifugation angewendet werden.
Eine Reihe von anerkannten Fluoreszenzsonden, wie Dihydroethidium (DHE), 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein-Diacetat (H2DCF-DA) und Dihydrorhodamin 123 (DHR), die die Zellmembran frei passieren, können zur Bestimmung der intrazellulären ROS durch Durchflusszytometrie, konfokale Mikroskopie oder Mikroplattenleser21,22,23,24verwendet werden. Neben dem Nachweis der DHE-Fluoreszenzsonde mit Mikroplattenleser könnten auch Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie verwendet werden, um die Veränderungen der Fluoreszenzintensität von DHE an den angegebenen Zeitpunkten zu erkennen, um die ROS-Produktion in Neutrophilen zu messen.
Dieses Protokoll bietet eine einfachere Möglichkeit, die ROS-Produktion in Echtzeit zu detektieren und kann in einer Vielzahl von Szenarien verwendet werden, um die ROS-Generation in Wirts-Säugetierzellen zu detektieren, die mit pathogenen Mikroorganismen infiziert sind.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) und dem Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
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