Summary
这里介绍的是在大约 1 周内从人多能干细胞定向分化的血源性内皮细胞的简单方案。
Abstract
血管普遍分布在身体的所有组织中，并执行不同的功能。因此，从人多能干细胞衍生出排列血管腔的成熟血管内皮细胞对于多种组织工程和再生应用至关重要。在体内，原始内皮细胞来源于中胚层谱系，并针对特定的亚型，包括动脉、静脉、毛细血管、血源性和淋巴管。血源性内皮细胞特别令人感兴趣，因为在发育过程中，它们会产生造血干细胞和祖细胞，然后在整个生命中产生所有血系。因此，创建一个在体外产生血源性内皮细胞的系统将为研究内皮到造血的转变提供机会，并可能导致人类血液制品的离体生产和减少对人类供体的依赖。虽然存在几种用于衍生祖细胞和原始内皮细胞的方案，但尚未描述从人类干细胞中产生特征明确的血源性内皮细胞。本文提出了一种在大约1周内从人胚胎干细胞衍生血源性内皮细胞的方法：分化方案，响应GSK3β抑制剂（CHIR99021）形成的原始条纹细胞，然后由bFGF介导的中胚层谱系诱导，然后是BMP4和VEGF-A促进的原始内皮细胞发育，最后是视黄酸诱导的血源性内皮细胞规格。该协议产生明确定义的血源性内皮细胞群，可用于进一步了解其分子调控和内皮到造血的转变，这有可能应用于下游治疗应用。
Introduction
内皮细胞（ECs）是一个异质细胞群，在整个人体和工程组织中执行多种功能。除了支持和调节其他细胞类型（即心肌细胞1，成骨细胞2）外，这些功能还包括在血液和组织之间形成选择性屏障并协助组织形成3。成熟EC在正常发育过程中的分化需要多样化的信号通路。原始 EC 来源于中胚层祖细胞，然后针对成熟的动脉、静脉、毛细血管和淋巴表型4 进行指定。此外，胚胎外卵黄囊和胚胎主动脉-性腺-中胚层（AGM）区域中的一小部分EC也被指定为血源性EC，其产生造血干细胞和祖细胞（HSPC）迁移到胎儿肝脏和胎儿骨髓，在那里它们在出生后保留并在整个生命中产生所有血细胞类型4。EC表型的多样性对于所有组织发育和维护都是必不可少的。
因此，EC及其衍生物是旨在建模和阐明人类发育和/或疾病以及再生医学和组织工程应用机制的研究的关键组成部分5，6，7，8。然而，这些类型研究的主要局限性是缺乏所需数量的初级人类ECs。据估计，大多数治疗应用至少需要 3 x 108 个 EC6。为了解决这个问题，已经提出了使用人类胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），因为它们具有不同的谱系潜力和产生大量后代的能力6，9。
事实上，源自hESC或hiPSC的细胞的有用性已经在多项专注于疾病建模和药物筛选的研究中得到证实10，11，12。器官芯片（OOC）技术已被用于通过将细胞和组织整合到三维支架中来更忠实地概括人体的生理学。此外，多个单独的OOC（所谓的人体或人芯片，BOC / HOC）的连接可以通过微流体完成，以允许感兴趣的器官之间的串扰13，14，15。支持组织，如脉管系统，是 OOC 和 BOC/HOC 的关键组成部分;结合脉管系统允许营养物质，氧气和旁分泌因子在整个组织中运输，从而促进必要的组织特异性微环境3，12。因此，推导成熟人类EC的方法，如动脉，静脉，淋巴管和血源性ECs，对于推进这些组织工程方法至关重要。
已经发布了多个协议，详细说明了从hESC或hiPSC5，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26衍生人类原始或祖EC的步骤.其中许多方案依赖于胚体（EB）形成或ESC / iPSCs与基质细胞的鼠饲养层共培养。这些策略往往既困难又耗时，EC产量低和/或人EC被鼠细胞污染。严格依赖2D培养而不使用基质细胞的方案通常需要长时间诱导，利用生长因子和/或抑制剂的复杂组合进行诱导，细胞分离后具有延长的扩增期，或这些因素的组合。推进对体内成熟EC类型衍生所涉及的信号通路和因素的了解，为简单而强大的体外分化方案奠定了基础。
以前，Notch和Retinoic Acid（RA）信号通路在发育过程中分别在小鼠动脉和血源性EC的规范中的关键作用被确定。Notch信号通路在动脉EC表型的规范和维持中起着多种作用。使用小鼠视网膜血管化模型的工作确定了流体剪切应力诱导Notch-Cx37-p27信号轴的途径，促进G1细胞周期停滞，从而使动脉EC规范27成为可能。据推测，细胞周期状态通过提供独特的机会窗口在细胞命运决策中发挥作用，在这些机会窗口中，细胞可以接受某些可以诱导基因表达和表型变化的信号28。这种Notch介导的G1停滞使富含动脉EC的基因表达，包括ephrinB2，Cx40，DLL4，Notch1和Notch 4（在29，30中审查）。还表明，通过RA信号传导31，32在体内促进血源性EC规范。其他研究发现，在RA信号传导的下游，c-Kit和Notch的表达上调p27，这使得鼠卵黄囊和AGM33中的产血性规范成为可能。小鼠血源性EC可以通过内皮（即CD31，KDR）和造血（即c-Kit，CD34）标志物的表达进行最低限度的鉴定4。最后，血源性EC经历内皮到造血的转变（EHT）形成HSPC，可以产生所有血细胞类型4，34，35。
最近的工作测试了这种相同的信号层次结构是否可以促进人类血源性EC规范。为此，开发了一种无血清和饲养层的2D培养方案，以从hESC中获取血源性EC，并且这些血源性EC在单细胞水平上表征为CD31 + KDR + c-Kit+ CD34 + VE-钙粘蛋白-CD45-。这项研究还利用了荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）报告基因，该报告基因使用表达FUCCI报告基因构建体（H9-FUCCI-hESC）的H9-hESC识别不同的细胞周期状态36。在这些细胞的研究中，证明RA促进EC中的早期G1细胞周期停滞，并且早期G1状态使体外血源性规范37成为可能。本文提供了用于分化这些人血源性内皮细胞的详细方案以及确认其身份的测定。这种简单的方法为未来研究人类血细胞发育的机制提供了一种有用的方法来生成这种专门的EC亚集。
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Protocol
1. 试剂和试剂制备
注意： 材料表中提供了试剂列表。
- 获得人类多能干细胞系：H1-hESC，H9-Fucci-hESC。
注意：在H1细胞系中，血源性EC的产生可能更有效。 - 制备基质蛋白储备液：将基质蛋白等分到预冷的 1.5 mL 管（冰上）中，使每个试管含有 1 mg 基质蛋白。1mg基质蛋白足以包被两个6孔板的所有孔（总共12个孔）。将等分试样储存在-20°C直至使用。
注意：在冰上或4°C下执行涉及基质蛋白的所有步骤。 将冷冻的基质蛋白储备瓶在4°C的冰上解冻过夜。解冻后，旋转小瓶以确保内容物混合。在-20°C下预冷1.5mL微量离心管至少1小时，并在等分试样前立即转移到冰上。 - 制备基质蛋白包被板：在4°C的冰上解冻基质蛋白等分试样。 将 12.5 mL 冰冷的 DMEM：F12 加入冰上预冷的锥形管中。利用预冷移液器吸头，将一等分试样（1 mg）基质蛋白转移到锥形管中，并通过上下移液充分混合。使用预冷血清移液管将 1 mL 稀释的基质蛋白等分到预冷的 6 孔板（冰上）的每个孔中。旋转和摇动板，使整个孔均匀涂覆。将板在室温下孵育至少30分钟，以使基质蛋白凝固。用封口膜包裹板，并在4°C下储存直至使用。在制备后 2 周内使用基质蛋白包被板。
注意：使用基质蛋白包被的6孔板进行细胞的常规传代和分化为原始和血源性内皮细胞。在冰上执行所有步骤。在-20°C下使用至少1小时之前，预冷却6孔板，移液器吸头，血清移液器和锥形管。 准备使用时将这些物品转移到冰上。 - 通过将 5 mL PFHM 加入 100 mL 多能干细胞分化培养基来制备基础分化培养基。储存在4°C。
- 通过将 0.1 g BSA 溶解在 100 mL PBS 中来制备 0.1% BSA-PBS。过滤器通过0.22μm过滤器对BSA-PBS进行灭菌，并储存在4°C。
- 用水以 1：2，400 的比例稀释 5 mM HCl（12 M）原液，制备 5 mM HCl。利用氢氧化钠将pH值调节至3.0。过滤器通过0.22μm过滤器对溶液进行灭菌，并储存在4°C。
- 准备 bFGF、BMP4、VEGF-A、维甲酸 （RA） 和 DLL4 储备液。
- bFGF：将冻干粉末在 0.1% BSA-PBS 中复溶至 100 μg/mL。等分并储存在-20°C。 在制备后 3 个月内使用 bFGF 储备液。使用前立即解冻等分试样。
- BMP4：将冻干粉末在 5mM HCl、pH 3.0 中复溶至 1 mg/mL。在 0.1% BSA-PBS 中进一步稀释至 50 μg/mL。等分并储存在-20°C。 在准备后 3 个月内使用 BMP4 储备液。使用前立即解冻等分试样。
- VEGF-A：将冻干粉末在 dH2O 中复溶至 1 mg/mL。在 0.1% BSA-PBS 中进一步稀释至 100 μg/mL。等分并储存在-20°C。 在准备后 3 个月内使用 VEGF-A 库存。使用前立即解冻等分试样。
- RA：在DMSO中将冻干粉末复溶至100mM。等分并储存在-80°C。 在准备后 1 个月内使用 RA 库存。使用前立即解冻等分试样。
注意：保护 RA 库存免受光照。 - DLL4：将冻干粉末在PBS中复溶至1 mg/mL。等分并储存在-20°C。 在准备后的 12 个月内使用 DLL4 库存。使用前立即解冻等分试样。
- 通过使用前立即通过在碱分化培养基中稀释VEGF-A和BMP4来制备内皮细胞分化培养基（步骤1.4），使最终浓度分别为25ng / mL和50 ng / mL。
- 在使用前立即准备工作RA，将DMSO中的100 mM储备液以1：1，000稀释至100μM。
注意：保护工作中的 RA 免受光照。 - 通过在碱分化培养基中稀释 VEGF-A、BMP4 和工作 RA（步骤 1.4），在使用前立即制备血源性内皮细胞分化培养基，使最终浓度分别为 25 ng/mL、50 ng/mL 和 0.5 μM。
- 通过制作含有10%FBS的HBSS来制备抗体染色缓冲液，并补充1：500稀释的抗菌试剂。无菌过滤缓冲液并立即使用。
- 通过制作含有1%FBS的HBSS来制备细胞分选缓冲液，并补充1：500稀释的抗菌试剂。无菌过滤缓冲液并立即使用。
- 通过将 5 mL 无菌水加入 5 mg 冻干纤连蛋白中来制备 1 mg/mL 纤连蛋白储备液。等分并储存在-20°C。 在冻干产品标签上的有效期之前使用纤连蛋白原液。使用前立即解冻等分试样。
- 准备纤连蛋白包被的35毫米培养皿。在无菌水中将纤连蛋白储备液（1 mg/mL）稀释至 4 μg/mL。向每个培养皿中加入1mL这种纤连蛋白包衣溶液，并在37°C下孵育30分钟至1小时。涂覆后立即使用培养皿。
- 按照制造商的说明制备 3 或 4 mL 等分试样的甲基纤维素基培养基。将等分试样储存在-20°C直至使用。在原液标签上标明的有效期之前使用基于甲基纤维素的培养基等分试样。使用前立即解冻等分试样。
- 通过将重组人 DLL4 原液稀释至 PBS 中的终浓度为 10 μg/mL，制备 DLL4 包衣溶液。
- 根据制造商的说明制备和储存内皮细胞生长培养基。
- 通过制作含有0.1%BSA的PBS来制备流式细胞术分析缓冲液。无菌过滤缓冲液并储存在4°C直至使用。
2. 细胞培养和hESC的传代
- 让基质蛋白包被的板、干细胞生长培养基和 DMEM：F12 升温至室温。
- 在 37 °C、5% CO 2 培养箱中的基质蛋白包被的 6 孔板上的干细胞生长培养基 （2 mL/孔） 中培养 hESC 细胞系。
- 每天检查细胞，并根据需要使用p200移液器吸头轻轻将其从板上刮下，从而去除分化的细胞。
注意：分化的细胞将出现在菌落的外围。有关培养中分化细胞的示例，请参阅干细胞生长培养基产品手册。 - 一旦细胞达到70%-80%汇合，就传代细胞。要传代细胞，请执行以下步骤。
注意：如果分化增加，细胞应在达到70%-80%汇合度之前分裂。- 取出细胞上方的培养基，每孔用 1 mL DMEM：F12 轻轻洗涤。
- 每孔加入 1 mL DMEM：F12。
- 每孔加入 160 μL/mL 分散酶，并将细胞在 37 °C 下在 5% CO2 培养箱中孵育 45 分钟。
- 分散酶孵育后，每孔额外加入 1 mL DMEM：F12，轻轻移液以提升细胞。
注意：避免将细胞解离成单细胞悬液。将细胞传代为小团块。 - 将细胞转移到含有 12 mL DMEM：F12 的锥形管中，并让细胞通过重力沉降（~5-10 分钟）。
- 除去上清液，每孔提升细胞轻轻重悬沉淀在0.5mL干细胞生长培养基中，以获得小团块细胞。
注意：避免将细胞解离成单细胞悬液。将细胞传代为小团块。 - 从制备的基质蛋白包被板的孔中吸出基质蛋白包被溶液，每孔加入1.5mL干细胞生长培养基。
- 将所需体积的重悬细胞（步骤2.4.6）加入到制备的基质蛋白包被板的每个孔中。
- 将板在37°C，5%CO2 培养箱中孵育。每24小时更换一次培养基至新鲜干细胞生长培养基。
3. hESCs分化为原始内皮细胞
- 第-1天：按照上述第2节所述培养和传代细胞。将细胞（步骤2.4.6）接种在小团块（~50μm）中，密度约为每平方厘米2个团块38。
注意：评估种子密度并在必要时根据经验进行细化。 - 第 0 天：接种细胞后 24 小时，从每个孔中吸出培养基，每孔用 1 mL DMEM：F12 轻轻洗涤细胞。向每个孔中加入 1 mL 含有 5 μM GSK3i（CHIR99021，新鲜添加）的基础分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
注意：对于所有洗涤步骤，通过移液板孔壁，将指示的洗涤介质缓慢添加到板上。轻轻旋转板，使孔的整个表面被洗涤介质覆盖。稍微倾斜板，使洗涤介质聚集在六点钟位置，并小心地吸出洗涤介质。 - 第 1 天：从每个孔中吸出培养基，并用每孔 1 mL DMEM：F12 轻轻洗涤细胞。向每个孔中加入 1 mL 含有 50 ng/mL bFGF（从冷冻原液中以 1：2，000 的新鲜添加）的基础分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
- 第 2 天：从每个孔中吸出培养基，每孔用 1 mL DMEM：F12 轻轻洗涤细胞。向每个孔中加入1mL内皮细胞分化培养基并孵育24小时（37°C，5%CO2）。
- 第 3 天：每孔用 1 mL 新鲜制备的内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
- 第 4 天：每孔用 1 mL 新鲜制备的内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
- 第 5 天：FACS 纯化细胞以评估 EC 表型（第 4-5 节）或保持培养并分化为血源性内皮细胞（第 6 节）。
4. 原代内皮细胞的FACS纯化
- 吸出细胞上方的培养基，每孔用 1 mL DMEM：F12 轻轻洗涤一次。
- 每孔加入 1 mL 细胞分离溶液，并将细胞在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 12 分钟，或直到细胞解离。
- 将解离的细胞转移到含有 12 mL DMEM：F12 的锥形管中，并通过离心 5 分钟、1，000 x g沉淀。
- 除去上清液并将沉淀重悬于 12 mL DMEM：F12 中洗涤。
- 通过离心5分钟，1，000× g沉淀细胞。
- 除去上清液并将细胞沉淀重悬于冰冷的抗体染色缓冲液中并计数细胞。使用冰冷的抗体染色缓冲液将浓度调节至 1 x 105 个细胞/mL。
- 将细胞均匀地分成冰上的微量离心管中，每个离心管至少含有 600 μL 细胞，浓度为 1 x 105 个细胞/mL，用于抗体染色。
注意：原始EC染色需要四管细胞：未染色对照，CD31单抗体对照，CD45单抗体对照以及含有CD31和CD45抗体的样品。有关抗体的信息在 材料表中提供。 - 酌情向含有细胞的试管中添加抗体，并在冰上孵育并避光30分钟。
- 未染色对照：不要添加任何抗体。
- CD31单抗对照：仅添加CD31抗体。
- CD45单抗对照：仅添加CD45抗体。
- 样品：添加CD31和CD45抗体。
注意：样品中的最终抗体浓度以及荧光偶联物应根据所使用的特异性抗体和细胞分选仪进行优化。
- 通过在4°C台式微量离心机中以1，000× g离心5分钟来沉淀细胞。
- 除去上清液，将细胞沉淀重悬于 600 μL 冰冷的分选缓冲液中。
- 通过 5 mL FACS 管的网状滤帽过滤样品，并将细胞储存在冰上避光，以便立即进行 FACS。
- 通过执行以下步骤获得原始内皮细胞（CD31 + CD45-）。
- 鉴定CD45阴性细胞群和门（CD45-）。
- 在 （CD45-） 内，鉴定 CD31 阳性 （CD31+） 细胞群并将细胞分选到 6 mL 冰冷细胞分选缓冲液中。将这些单元用于下游应用（请参阅第 5 节）。
5. 确认原始内皮细胞表型的测定
- 用 1 mL/孔 DLL4 包衣溶液涂覆 6 孔板的三个孔在 37 °C、5% CO2 培养箱中涂覆 30 分钟。作为对照，用 1 mL/孔 PBS 模拟涂覆板的其他三个孔。
- 吸出DLL4包衣溶液和PBS，并在每孔2mL内皮细胞生长培养基中接种25，000个分选的原始内皮细胞（参见步骤4.12）。
- 将细胞在37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
- 吸出细胞上方的培养基，并用 2 mL/孔 PBS 洗涤一次。通过qPCR或流式细胞术分析细胞（用于表达FUCCI构建体的细胞）。
- 要通过qPCR分析细胞，请执行以下步骤。
- 根据制造商的方案，吸出细胞上方的液体并使用RNA提取试剂盒分离细胞中的RNA。
- 根据制造商的方案使用逆转录预混液进行逆转录反应。
- 根据制造商的方案，使用SYBR绿色预混液进行qPCR反应。
注意：使用的引物（EFNB2，GJA5，GJA4，NR2F2，EPHB4，HEY2）列于 表1中。
- 要通过流式细胞术分析表达FUCCI构建体的细胞，请执行以下步骤。
- 吸出细胞上方的液体，并加入 500 μL/孔 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。
- 将细胞在37°C的5%CO2培养箱中孵育直至提起，~5分钟。
- 将细胞转移到微量离心管中，并在4°C微量离心机中以1，000× g沉淀细胞5分钟。
- 吸出上清液并将沉淀重悬于500μL冰冷的流式细胞术分析缓冲液中。
- 通过 5 mL FACS 管的网状滤帽过滤样品，并将细胞储存在冰上避光，以便立即进行流式细胞术分析。
- 分析早期G1（无颜色），晚期G1（mCherry+/mVenus-），G1 / S（mCherry+/mVenus+）和S / G2 / M（mCherry-/mVenus+）中接种在DLL4上的细胞与PBS对照的百分比。
- 要通过qPCR分析细胞，请执行以下步骤。
6. hESCs分化为血源性内皮细胞
注意：将细胞分化为第 4 天原始 EC，如上文第 3.1-3.6 节所述。
- 第 5 天：吸出细胞上方的培养基，每孔用 1 mL DMEM：F12 轻轻洗涤细胞。每孔加入1mL新鲜制备的血源性内皮细胞分化培养基，孵育24小时（37°C，5%CO2）。
- 第 6 天：每孔用 1 mL 新鲜制备的血源性内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
- 第7天：每孔用1mL新鲜制备的血源性内皮细胞分化培养基替换细胞上方的培养基，孵育24小时（37°C，5%CO2）。
- 第8天：FACS分离血源性内皮细胞（见第7节）。
7. 血源性内皮细胞的FACS分离
- 按照上述第 4.1-4.6 节所述提起并清洗细胞。
- 将细胞均匀地分成冰上的微量离心管中，每个离心管至少含有 600 μL 细胞，浓度为 1 x 105 个细胞/mL，用于抗体染色。
注意：血源性EC的抗体染色需要八管细胞：未染色对照，CD31单抗体对照，CD45单抗体对照，KDR单抗体对照，c-Kit单抗体对照，CD34单抗体对照，VE-钙粘蛋白单抗体对照，以及含有所有六种抗体的样品。
注意：抗体信息在 材料表中提供。 - 酌情向含有细胞的试管中添加抗体，并在冰上孵育并避光30分钟。
- 未染色对照：不要添加抗体。
- CD31单抗对照：仅添加CD31抗体。
- CD45单抗对照：仅添加CD45抗体。
- KDR 单抗体对照：仅添加 KDR 抗体。
- c-Kit 单抗体对照：仅添加 c-Kit 抗体。
- CD34单抗对照：仅添加CD34抗体。
- VE-钙粘蛋白单抗体对照：仅添加 VE-钙粘蛋白抗体。
- 样品：添加 CD31、CD45、KDR、c-Kit、CD34 和 VE-钙粘蛋白抗体。
注意：样品中的最终抗体浓度以及荧光偶联物应根据所使用的特异性抗体和细胞分选仪进行优化。
- 通过在4°C微量离心机中以1，000× g离心5分钟来沉淀细胞。
- 除去上清液并将沉淀重悬于 600 μL 冰冷的分选缓冲液中。
- 通过 5 mL FACS 管的网状滤帽过滤样品，并将细胞储存在冰上避光，立即进行 FACS。
- 要获得血源性内皮细胞（CD31 + KDR + c-Kit+ CD34 + VE-钙粘蛋白-CD45-），请执行以下步骤。
- 鉴定CD45-细胞群和门（CD45-）。
- 在（CD45-）内，鉴定CD31 +细胞群和门（CD31 +）。
- 在（CD31+）内，鉴定VE-钙粘蛋白细胞群 和门（CDH5-）。
- 在（CDH5-）内，鉴定c-Kit+细胞群和门（KIT+）。
- 在 （KIT+） 内，鉴定 CD34+ 细胞群和门 （CD34+）。
- 在 （CD34+） 中，鉴定 KDR+ 细胞并将其分选到 6 mL 冰冷细胞分选缓冲液中。在下游应用中使用这些单元（参见第 8 节）。
8. 菌落形成单位测定
- 按照制造商的说明解冻甲基纤维素基培养基的等分试样。
注意：一个 3 mL 等分试样足以用于两个样品，一个 4 mL 等分试样足以用于三个样品。 - 计数在步骤7.7中获得的分选的血源性内皮细胞。
- 按照制造商的说明，计算要添加到每个甲基纤维素基培养基等分试样中的分选细胞的体积，以便每个样品至少包含 1，000 个血源性内皮细胞。
注意：可以根据需要调整单元格数量。 - 将计算出的细胞体积加入甲基纤维素基培养基等分试样中并彻底涡旋。让基于甲基纤维素的培养基培养物在室温下静置10分钟，或直到气泡消散。
- 从准备好的35毫米培养皿中吸出纤连蛋白涂层溶液。按照制造商的说明，每 35 mm 培养皿分配 1 mL 基于甲基纤维素的培养基培养物。轻轻旋转培养皿以均匀分布培养物。
- 将这些 35 mm 培养皿以及另外两个装满无菌水的 35 mm 培养皿放入 15 cm 组织培养皿中。
- 将培养物在37°C，5%CO2 培养箱中孵育，并在第8天和第14天观察培养物。
- 在第8天，计数CFU-E和BFU-E菌落。
- 在第14天，计算CFU-GM和CFU-GEMM菌落。
注意：请参阅基于甲基纤维素的培养基手册，了解菌落类型的形态学鉴定。
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Representative Results
图1显示了概述hESC的原始EC和血源性EC的规格的示意图，以及电镀后24小时细胞的代表性图像。按照规范，原始EC和血源性EC分别在第5天和第8天纯化FACS。原始EC定义为CD31 + CD45-，血源性EC定义为CD31+ KDR + c-Kit+ CD34+ VE-钙粘蛋白-CD45-。用于原始EC和血源性EC纯化的代表性流式细胞术门控策略如图2所示。最初根据CD45的阴性表达和CD31的阳性表达对细胞进行门控，以获得纯化的原始ECs（图2A）。为了获得纯化的血源性ECs，最初如图2A所示对细胞进行门控，然后根据VE-钙粘蛋白（CDH5），c-Kit（KIT），CD34和KDR的阳性或阴性表达进一步纯化（图2B）。
为了评估H9-Fucci-hES衍生的原始CD31 + CD45- 内皮细胞的潜力，在分化的第5天通过FACS分离（方案第4部分）产生内皮亚型，将纯化的细胞接种到涂有Notch配体DLL4以诱导动脉规格或PBS（对照）的平板上，并在37°C下孵育24小时， 5% CO2 培养箱。然后用RNA裂解缓冲液裂解细胞，提取RNA并逆转录为cDNA，并进行qPCR以比较DLL4处理的细胞与对照细胞中的基因表达水平。正如预期的那样，在DLL4上生长的内皮细胞增加了Notch响应基因HEY2以及动脉相关基因EFNB2，GJA5和GJA4的表达。此外，这些细胞的静脉转录因子NR2F2的表达也降低（图3A）。或者，为了确定DLL4处理对细胞周期状态的影响，将FACS纯化的CD31 + CD45-细胞在涂有DLL4或PBS的平板上孵育24小时，提起，并根据hCdt1（30/120）-mCherry（晚期G1）和hGem（1/110）- mVenus（S / G2 / M）的表达进行分析。与Notch信号传导促进晚期G1细胞周期停滞27的发现一致，与对照细胞相比，在DLL4存在下生长后，在G1晚期被阻滞的原始EC的比例更高（图3B，C）。
为了验证血源性内皮细胞的造血潜力，将通过FACS（第7节中的方法）分离的CD31 + KDR + c-Kit+ CD34 + VE-钙粘蛋白-CD45-内皮细胞接种在为集落形成单位（CFU）测定中造血祖细胞生长而配制的甲基纤维素基培养基中，并允许生长14天。在第 8 天计数 CFU-E 红系菌落和原始细胞形成单位 （BFU）-E 红系菌落（图 4A，B），在第 14 天计数 CFU-GM 粒细胞/巨噬细胞和 GFU-GEMM（粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核细胞）多能造血祖细胞集落（图 4C 和 D）。每接种 1，000 个血源性 EC，产生大约 20 CFU（图 4F）。在培养物中也可以看到具有内皮细胞形态的细胞（图4E）;这些是血源性内皮细胞，在单细胞水平上产生多谱系造血祖细胞37。
图1：原始和血源性EC规范方案 。 （A）分化方案示意图。胚胎干细胞在第-1天接种在基质蛋白包被的平板上，并使其附着过夜。然后在第0天和第1天分别用GSK3i抑制剂（CHIR99021）和bFGF处理细胞，以分别诱导原始条纹和中胚层规格。从第2天开始，用BMP4和VEGF-A的组合处理细胞以促进原始EC发育。原始EC（红色圆圈）在第5天纯化FACS。或者，为了产生血源性 EC，在第 5 天将原始 EC 上方的培养基交换为含有 BMP4、VEGF-A 和 RA 的新鲜血源性分化培养基。该培养基每天更换，直到第8天，此时血源性ECs（红星）被纯化FACS。（B）分化第0天的菌落，比例尺= 100μm。经爱思唯尔许可，面板 A 已从 Qiu 等人 37 修改而来。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：源自 hESC 的血源性 EC 的 FACS 分析。 代表性的流式细胞术门控策略，用于纯化（A）原始EC和（B）血源性ECs。请注意，由于血源性EC来源于原始EC，因此CD45和CD31的流式细胞术门控策略对于两个细胞群是相同的。每个面板（样品）的顶行显示的是如方案第6节所述分化为血源性EC并用方案第7.3.8节中所述的抗体染色的细胞。每个面板（对照）的底行显示的是未染色的细胞，这些细胞在没有RA处理的情况下分化了8天。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：H9-Fucci CD31+ CD45-原始内皮细胞的 DLL4 诱导导致晚期 G1 停滞和动脉基因表达增加。 （A）DLL4处理CD31 + CD45- H9-hESC-衍生的原始内皮细胞表达在分化第5天纯化的Fucci构建体导致动脉基因（i-iii）和Notch响应基因Hey2（v）的表达增加， 伴随着静脉基因NR2F2（iv）表达的降低。（B）代表性FACS图显示了在PBS（对照）或DLL4上生长24小时的5，000个H9-Fucci衍生的CD31 + CD45-的细胞周期状态分布。 （C）与对照相比，DLL4诱导导致G1期晚期细胞增加15%。数据是图（B）所示的同一实验中一式三份样品的平均值。误差线表示标准偏差。请点击此处查看此图的大图。
图 4：源自 hESC 的血源性 EC 的造血潜力分析。代表性图像显示了 H1-hESC 衍生的 （A） CFU-E 红系菌落（比例尺 = 35 μm）、（B） BFU-E 红系菌落（比例尺 = 75 μm）、（C） CFU-GM 粒细胞/巨噬细胞集落、（D） CFU-GEMM 多能造血祖细胞集落和 （E） CFU-GM 粒细胞/巨噬细胞集落与底层内皮细胞 （EC）（红色箭头）。（F）每1，000个铺板的血源性内皮细胞形成的CFU的数量和分布。比例尺 = 100 μm 英寸 （C-E）。使用该协议分化的CFU的其他图像可以在Qiu等人37中找到。面板F经爱思唯尔许可从Qiu等人37修改而来。请点击此处查看此图的大图。
| 名字 | 向前 | 反向 |
| EFNB2 | TATGCAGAACTGCGATTTCCAA | TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC |
| EPHB4 | CGCACCTACGAAGTGTGA | GTCCGCATCGCTCTCATAGTA |
| GJA5 | CCGTGGTAGGCAAGGTCTG | ATCACACCGGAAATCAGCCTG |
| GJA4 | ACACCCACCCTGGTCTAC | CACTGGCGACATAGGTGCC |
| 嘿2 | GCCCGCCTTGTCAGTATC | CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG |
| NR2F2 | GGACCACATACGGATCTTCCAA | ACATCAGACAGACCACAGGCAT |
表1：qPCR引物信息
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Discussion
本文概述了使用无小鼠饲养层和无血清的2D培养系统在大约1周内从人胚胎干细胞生产血源性内皮细胞的步骤（图1）。该协议扩展了Sriram等人（2015）描述的方法，以获得原始ECs 38。通过在DLL4包被的平板上培养这些细胞并观察符合动脉规格的基因表达变化，证明了CD31 + CD45-EC的原始性质和规格潜力（图3）。此外，动脉身份的获得与晚期G1细胞周期停滞有关（图3），这与以前的研究一致27。在 0.5 μM RA、25 ng/mL BMP4 和 50 ng/mL VEGF-A 存在下再培养 3 天后，可以生成和分离 FACS 血源性 EC（图 2），这些 ECC 能够产生 CFU-红细胞、BFU-红细胞、CFU-粒细胞/巨噬细胞和 CFU-粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核细胞集落（图 4).在最近发表的一项研究中使用这种方法，观察到基因表达在 8 天内的变化与多能性丧失、原始条纹和中胚层诱导、内皮细胞身份获得以及最终造血特性一致37。此外，RA处理诱导早期G1细胞周期停滞，以实现血源性EC规范37。
最近，Ohta等人（2019）描述了一种从hPSC39中区分血源性EC的方案。然而，上述协议提供了显着的优点：1）该方法不需要形成微球;2）本协议使用标准的37°C，5%CO2培养箱而不是缺氧培养箱，无需专用专用设备;3）该协议仅使用一种培养基（补充有PFHM的多能干细胞分化培养基），这是一个节省成本的优势，而太田方案需要两种培养基进行诱导。Galat等人（2017）最近发表的另一项研究描述了一种方案，其中利用CHIR99021诱导产生CD34 +血源性内皮细胞群40。这些细胞也表达CD31，并且在单层条件下培养时能够产生内皮细胞，或者在存在其他细胞因子的情况下分别与OP9或OP9-DLL4细胞共培养后表达骨髓和淋巴标志物的细胞。对额外共培养的需求可能导致小鼠细胞对所需细胞群的潜在污染。此外，尽管Ohta等人和Galat等人使用的血源性诱导期比此处描述的短（分别为4天和5天与8天），但两者都将血源性EC定义为CD34 +，而该协议使用了更严格的定义：CD31 + KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-钙粘蛋白- CD45-.虽然CD34被认为是造血细胞的标志物，但它也由其他非造血细胞类型表达，例如间充质基质细胞和内皮细胞41。因此，该协议中血源性EC的定义（CD31 + KDR + c-Kit+ CD34 + VE-钙粘蛋白-CD45-）更加严格，并且代表更明确的人群。
在治疗应用中使用 hESC 或 hiPSC 的一个限制是需要大量细胞，标准 2D 衍生方法主要限于小规模分化。利用hiPSC系，Olmer等人（2018）证明了利用悬浮培养物或搅拌罐生物反应器6扩大表达动脉（DLL4）和静脉（EPHB4）细胞标志物的功能性CD31 + ECs生产的可行性。重要的是，他们表明他们能够从含有20mL悬浮培养物的单个烧瓶中获得1.18 x 107 CD31 + ECs，这些ECs共表达CD34和KDR。为了获得大多数治疗应用所需的 3 x 108 EC，只需要两个多于 500 mL 的烧瓶6。未来的实验应探索将缩放技术应用于此处提出的大规模生产血源性EC的协议。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH拨款HL128064和U2EB017103的部分支持。CT Innovations 15-RMB-YALE-04赠款提供了进一步的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
| 35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
| 6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
| Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
| FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 μg/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
| Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
| Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
| Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
| Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
| RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
| α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
| α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
| α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
| α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
| * Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |
References
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
- Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
- Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
- Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
- Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
- Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
- Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
- Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
- Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
- Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
- Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
- Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
- Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
- Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
- Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
- Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
- Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
- Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
- Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
- Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
- Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
- Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).
