Preparazione di omogenati muscolari scheletrici di ratto per misurazioni di nitrati e nitriti
Summary
Presentiamo protocolli per tre diversi metodi per l’omogeneizzazione di quattro diversi gruppi muscolari di tessuto muscolare scheletrico di ratto per misurare e confrontare i livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, confrontiamo diversi pesi del campione per indagare se la dimensione del campione di tessuto influisce sui risultati dell’omogeneizzazione.
Abstract
Una volta si pensava che gli ioni nitrato (NO3–) fossero prodotti finali inerti del metabolismo dell’ossido nitrico (NO). Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che gli ioni nitrato possono essere riconvertiti in NO nei mammiferi attraverso un meccanismo di riduzione in due fasi: il nitrato viene ridotto a nitrito (NO2–) principalmente dai batteri commensali orali, quindi il nitrito viene ridotto a NO da diversi meccanismi, tra cui proteine contenenti eme o molibdeno. Questa via riduttiva dei nitrati contribuisce a migliorare le vie di segnalazione NO-mediate, in particolare nel sistema cardiovascolare e durante l’esercizio muscolare. I livelli di nitrato nell’organismo prima di tale utilizzo sono determinati da due diverse fonti: l’ossidazione endogena di NO e l’assunzione di nitrati nella dieta, principalmente dalle piante. Per chiarire il complesso ciclo dell’NO in circostanze fisiologiche, abbiamo esaminato ulteriormente la dinamica dei suoi metaboliti, nitrati e ioni nitriti, che sono relativamente stabili rispetto a NO. In studi precedenti il muscolo scheletrico è stato identificato come un importante organo di stoccaggio per gli ioni nitrato nei mammiferi, nonché una fonte diretta di NO durante l’esercizio. Pertanto, stabilire una metodologia affidabile per misurare i livelli di nitrati e nitriti nel muscolo scheletrico è importante e dovrebbe essere utile per estenderne l’applicazione ad altri campioni di tessuto. Questo articolo spiega in dettaglio la preparazione di campioni di muscolo scheletrico, utilizzando tre diversi metodi di omogeneizzazione, per misure di nitrati e nitriti e discute importanti questioni relative ai processi di omogeneizzazione, compresa la dimensione dei campioni. Le concentrazioni di nitrati e nitriti sono state confrontate anche in quattro diversi gruppi muscolari.
Introduction
L’ossido nitrico (NO), una piccola molecola di segnalazione gassosa, svolge un ruolo critico nei processi fisiologici e fisiopatologici1. L’NO può essere prodotto dalla L-arginina da enzimi endogeni della famiglia delle ossidi nitrici sintasi (NOS) prima di subire una rapida ossidazione a nitrato (NO 3-) e, possibilmente, nitrito (NO 2–) nel sangue e nei tessuti 2,3. Recentemente, questi anioni hanno dimostrato di essere ridotti a NO nei sistemi di mammiferi4. Il nitrato viene convertito in nitrito, principalmente dalle nitrati reduttasi batteriche commensali nella cavità orale che agiscono sugli ioni secreti dalle ghiandole salivari e ingeriti direttamente 5 e, in una certa misura, dagli enzimi dei mammiferi come la xantina ossidoreduttasi 6,7. Il nitrito può essere ulteriormente ridotto a NO da diversi meccanismi tra cui la deossiemoglobina8, la desossimioglobina9, gli enzimi contenenti molibdeno 10 e la riduzione non enzimatica in presenza di protoni11,12.
Questa via nitrato-nitrito-NO è migliorata in condizioni ipossiche in cui l’attività NOS è diminuita perché NOS richiede ossigeno per la generazione di NO4. Molti studi recenti hanno riportato effetti benefici del nitrato alimentare sulla regolazione della pressione sanguigna e sulle prestazioni fisiche, suggerendo che i percorsi di riduzione dei nitrati contribuiscono all’aumento della segnalazione NO13,14,15. Studi precedenti hanno dimostrato che alcuni muscoli scheletrici sono probabilmente i principali luoghi di stoccaggio dei nitrati nel corpo16. Rispetto al sangue o ad altri organi interni come il fegato, il muscolo scheletrico (gluteus maximus) contiene livelli significativamente più elevati di nitrato e ha una massa sostanziale nel corpo dei mammiferi. L’esercizio del tapis roulant ha dimostrato di migliorare la riduzione dei nitrati a nitriti e a NO nei glutei in un modello di ratto7. Questi risultati implicano che alcuni muscoli scheletrici potrebbero essere importanti fonti di NO attraverso percorsi di riduzione dei nitrati in situazioni fisiologiche. Studi più recenti suggeriscono che questi risultati, compresi i cambiamenti nei livelli di nitrati muscolari durante l’esercizio, si verificano anche negli esseri umani17.
Due degli attuali autori avevano precedentemente stabilito un metodo per misurare i livelli di nitrati e nitriti nel sangue e in altri campioni liquidi18. Tuttavia, quando i livelli di questi anioni negli omogenati tissutali sono stati inizialmente analizzati, non erano disponibili protocolli dettagliati. Per comprendere le dinamiche nitrati-nitriti-NO in diversi organi, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo accurato ed efficiente per misurare i livelli di nitrati e nitriti nei tessuti dei mammiferi, incluso il muscolo scheletrico. In studi precedenti, i tessuti dei roditori sono stati utilizzati per sviluppare processi di omogeneizzazione affidabili e quindi analizzare il contenuto di nitrati e nitriti in quegli omogenati 7,16,19. L’uso di questo metodo di omogeneizzazione è stato esteso ai campioni di biopsia del muscolo scheletrico umano, per cui i valori sono stati confermati e, soprattutto, i valori osservati per il muscolo rispetto al sangue / plasma erano in intervalli e rapporti simili a quelli osservati nei roditori17. Negli ultimi anni, anche altri gruppi hanno iniziato a misurare i livelli di nitrati e nitriti negli omogenati muscolari scheletrici, riportando valori comparabili a quelli riportati dal nostro gruppo20,21.
Lo scopo di questo documento protocollare è quello di descrivere in dettaglio la preparazione di omogenati muscolari scheletrici utilizzando tre diversi metodi di omogeneizzazione per la successiva misurazione dei livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, sono stati esaminati gli effetti del peso tissutale utilizzato per l’omogeneizzazione sui valori di nitrati e nitriti nei campioni di muscolo scheletrico. Crediamo che questi metodi possano essere facilmente applicati ad altri tipi di tessuti di mammiferi. Recentemente, soprattutto nel campo della fisiologia dell’esercizio, è stata prestata attenzione alle possibili differenze nella fisiologia nitrati/nitriti/NO in base ai gruppi muscolari. Riportiamo anche le quantità di nitrati e nitriti in quattro diversi muscoli dei roditori e troviamo una distribuzione non uniforme di entrambi gli ioni tra questi diversi muscoli; un’osservazione che richiede ulteriori studi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per monitorare i cambiamenti nei metaboliti di NO, nitrati e nitriti, in funzione degli interventi fisiologici, è imperativo misurare i livelli di questi ioni nei diversi organi che sono critici nel loro metabolismo. Poiché l’emoglobina nel sangue reagisce con NO e i suoi metaboliti, è anche importante rimuovere rapidamente il sangue dai campioni di tessuto il più possibile. Così gli animali sono stati perfusi con soluzione salina prima di raccogliere i tessuti muscolari scheletrici (glutei, TA, EDL, muscolo gastroc…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione intramurale NIH / NIDDK ZIA DK 0251041-14 AD Alan N Schechter, MD.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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