Wir präsentieren Protokolle für drei verschiedene Methoden zur Homogenisierung von vier verschiedenen Muskelgruppen von Ratten-Skelettmuskelgewebe, um die Nitrat- und Nitritwerte zu messen und zu vergleichen. Darüber hinaus vergleichen wir verschiedene Probengewichte, um zu untersuchen, ob die Gewebeprobengröße die Ergebnisse der Homogenisierung beeinflusst.
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Methodenartikel
Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nitrationen (NO3-) galten früher als inerte Endprodukte des Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechsels. Frühere Studien zeigten jedoch, dass Nitrationen bei Säugetieren durch einen zweistufigen Reduktionsmechanismus wieder in NO umgewandelt werden können: Nitrat wird hauptsächlich von oralen kommensalen Bakterien zu Nitrit (NO2-) reduziert, dann wird Nitrit durch verschiedene Mechanismen, einschließlich über Häm- oder Molybdän-haltige Proteine, zu NO reduziert. Dieser reduktive Nitratweg trägt zur Verbesserung der NO-vermittelten Signalwege bei, insbesondere im Herz-Kreislauf-System und bei Muskeltraining. Der Nitratgehalt im Körper vor einer solchen Verwertung wird durch zwei verschiedene Quellen bestimmt: endogene NO-Oxidation und Nitrataufnahme über die Nahrung, hauptsächlich aus Pflanzen. Um den komplexen NO-Zyklus unter physiologischen Bedingungen aufzuklären, haben wir die Dynamik seiner Metaboliten, Nitrat- und Nitritionen, die im Vergleich zu NO relativ stabil sind, weiter untersucht. In früheren Studien wurde die Skelettmuskulatur als Hauptspeicherorgan für Nitrationen bei Säugetieren sowie als direkte Quelle von NO während des Trainings identifiziert. Daher ist die Etablierung einer zuverlässigen Methodik zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in der Skelettmuskulatur wichtig und sollte hilfreich sein, um ihre Anwendung auf andere Gewebeproben auszudehnen. Dieser Artikel erläutert ausführlich die Vorbereitung von Skelettmuskelproben mit drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden für Nitrat- und Nitritmessungen und diskutiert wichtige Fragen im Zusammenhang mit Homogenisierungsprozessen, einschließlich der Größe der Proben. Nitrat- und Nitritkonzentrationen wurden auch über vier verschiedene Muskelgruppen hinweg verglichen.
Einleitung
Stickstoffmonoxid (NO), ein kleines gasförmiges Signalmolekül, spielt eine entscheidende Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen1. NO kann aus L-Arginin durch endogene Enzyme der Familie der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) hergestellt werden, bevor es einer schnellen Oxidation zu Nitrat (NO3-) und möglicherweise Nitrit (NO2-) in Blut und Geweben 2,3 unterzogen wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese Anionen in Säugetiersystemen wieder zu NO reduziert werden4. Nitrat wird in Nitrit umgewandelt, haup....
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Protokoll
Das Tierprotokoll wurde vom NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20) genehmigt. Die Tiere wurden gemäß dem aktuellen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt und behandelt, der auf der AAALAC-Website frei verfügbar ist.
1. Sammlung von Skelettmuskeln der Ratte
- Während eine Ratte unter tiefer Narkose steht (5% Isofluran, bestätigt durch fehlende Reaktion auf Schwanz- / Beinklemmung), beginnen Sie mit der Perfusion mit Heparin-haltiger Kochsalzlösung, indem Sie eine 19-G-Nadel in eine Spitze des linken Ventrikels einführen und einen Nick im rechten Vorhof machen. Kochsalzlösung mit Heparin durch....
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Ergebnisse
Um repräsentative Ergebnisse zu erhalten, wurde Skelettmuskelgewebe von 8 Wistar-Ratten (Männchen und Weibchen, Gewicht 250 ± 50 g) verwendet. Ratten-Skelettmuskelhomogenate (50 mg Musculus gluteus maximus für jede Methode) wurden mit drei verschiedenen Homogenisierungswerkzeugen (rotierender Homogenisator, Perlenhomogenisator und Pulverisierer) hergestellt. Die Nitrat- und Nitritgehalte dieser Homogenate wurden dann mit einem Stickstoffmonoxid-Analysator (NOA) bestimmt (Abbildung 4). Die Ni.......
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Diskussion
Um Veränderungen der NO-Metaboliten, Nitrat und Nitrit, in Abhängigkeit von physiologischen Eingriffen zu überwachen, ist es unerlässlich, die Spiegel dieser Ionen in den verschiedenen Organen zu messen, die für ihren Stoffwechsel entscheidend sind. Da Hämoglobin im Blut mit NO und seinen Metaboliten reagiert, ist es auch wichtig, Blut so schnell wie möglich aus Gewebeproben zu entfernen. So wurden die Tiere mit Kochsalzlösung perfundiert, bevor sie Skelettmuskelgewebe (Gesäß, TA, EDL, Gastrocnemius-Muskel) sammelten, un.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Alan N. Schechter ist als Miterfinder mehrerer Patente aufgeführt, die an die National Institutes of Health für die Verwendung von Nitritsalzen zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erteilt wurden. Er erhält Lizenzgebühren auf der Grundlage der NIH-Lizenzierung dieser Patente für die klinische Entwicklung, aber keine andere Vergütung. Diese Vereinbarungen haben keinen Einfluss auf seine Einhaltung der JoVE-Zeitschriftenrichtlinien.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch das interne NIH / NIDDK-Stipendium ZIA DK 0251041-14 an Alan N Schechter, MD, unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| gentleMACS Dissoziator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M Rohr | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Länge: 87 mm; Durchmesser: 30 mm |
| Heparin Natrium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isofluran | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys Bead Homogenisator | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-Ethylmaleimid | Sigma | 4260 | |
| Stickstoffmonoxid-Analysator | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylenglykol | Sigma | 74385 | |
| Kaliumferricyanid; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys Lysekit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | enthält 2 ml-Röhrchen mit 2,8 mm Keramikkügelchen (Zirkonoxid) für die Homogenisierung |
| Pulverisierer-Kit | Cellcrusher | Cellcrusher-Kit |
Referenzen
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New....
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Nachdrucke und Genehmigungen
