Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni delle vescicole extracellulari

Summary

Dimostriamo come utilizzare un nuovo strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle per stimare la distribuzione dimensionale e la concentrazione totale di particelle di vescicole extracellulari isolate dal tessuto adiposo perigonadale di topo e dal plasma umano.

Abstract

I ruoli fisiologici e fisiopatologici delle vescicole extracellulari (EV) sono diventati sempre più riconosciuti, rendendo il campo EV un’area di ricerca in rapida evoluzione. Esistono molti metodi diversi per l’isolamento dei veicoli elettrici, ognuno con vantaggi e svantaggi distinti che influenzano la resa a valle e la purezza dei veicoli elettrici. Pertanto, caratterizzare la preparazione EV isolata da una determinata fonte con un metodo scelto è importante per l’interpretazione dei risultati a valle e il confronto dei risultati tra i laboratori. Esistono vari metodi per determinare le dimensioni e la quantità di veicoli elettrici, che possono essere alterati da stati patologici o in risposta a condizioni esterne. L’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è una delle tecnologie di spicco utilizzate per l’analisi ad alto rendimento di singoli veicoli elettrici. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni dei veicoli elettrici isolati dal tessuto adiposo perigonadale del topo e dal plasma umano utilizzando una tecnologia rivoluzionaria per NTA che rappresenta i principali progressi nel campo. I risultati dimostrano che questo metodo può fornire dati riproducibili e validi sulla concentrazione totale di particelle e sulla distribuzione delle dimensioni per veicoli elettrici isolati da fonti diverse utilizzando metodi diversi, come confermato dalla microscopia elettronica a trasmissione. L’adattamento di questo strumento per NTA affronterà la necessità di standardizzazione nei metodi NTA per aumentare il rigore e la riproducibilità nella ricerca EV.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole (0,03-2 μm) vescicole legate alla membrana secrete da quasi tutti i tipi di cellule¹. Sono spesso indicati come “esosomi”, “microvescicole” o “corpi apoptotici” a seconda del loro meccanismo di rilascio e della dimensione². Mentre inizialmente si pensava che gli EV fossero semplicemente un mezzo per eliminare i rifiuti dalla cellula per mantenere l’omeostasi³, ora sappiamo che possono anche partecipare alla comunicazione intercellulare tramite il trasferimento di materiale molecolare – tra cui DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipidi e proteine^4,5 – e che sono importanti regolatori della normale fisiologia e dei processi patologici^{1, 5,6,7,8}.

Esistono molti metodi diversi per isolare e quantificare i veicoli elettrici, che sono stati descritti altrove^9,10,11,12. Il protocollo di isolamento utilizzato e la fonte dei veicoli elettrici possono influire notevolmente sulla resa e sulla purezza dei veicoli elettrici. Anche la centrifugazione differenziale, a lungo considerata l’approccio “gold standard” per l’isolamento degli esosomi, può essere soggetta a una sostanziale variabilità che successivamente influisce sulla popolazione EV ottenuta e sulle analisi a valle^13. Pertanto, le varie metodologie diverse per l’isolamento e la quantificazione dei veicoli elettrici rendono difficile confrontare, riprodurre e interpretare i risultati degli esperimenti riportati nella letteratura¹⁴. Inoltre, il rilascio di EV può essere regolato da condizioni cellulari o vari fattori esterni. È stato suggerito che gli EV svolgono un ruolo nel mantenimento dell’omeostasi cellulare proteggendo le cellule dallo stress intracellulare¹⁵, poiché diversi studi hanno dimostrato che lo stress cellulare stimola la secrezione ev. Ad esempio, è stato riportato un aumento del rilascio di EV dopo l’esposizione cellulare a ipossia, stress del reticolo endoplasmatico, stress ossidativo, stress meccanico, estratto di fumo di sigaretta e inquinamento atmosferico da particolato^{16,17, 18,19,20,21,22.} Il rilascio di EV ha anche dimostrato di essere modificato in vivo; topi sottoposti a una dieta ricca di grassi o a digiuno per sedici ore hanno rilasciato più EV di adipociti²³. Per indagare se un trattamento o una condizione specifica altera il rilascio di veicoli elettrici, il numero di veicoli elettrici deve essere determinato con precisione. La valutazione della distribuzione delle dimensioni dei veicoli elettrici può anche indicare l’origine subcellulare predominante dei veicoli elettrici (ad esempio, fusione di endosomi tardivi/corpi multivesicolari con la membrana plasmatica rispetto al germogliamento della membrana plasmatica)²⁴. Pertanto, vi è la necessità di metodi robusti per misurare con precisione la concentrazione totale e la distribuzione dimensionale della preparazione EV in fase di studio.

Un metodo rapido e altamente sensibile per la visualizzazione e la caratterizzazione dei veicoli elettrici in soluzione è l’analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Una spiegazione dettagliata dei principi di questo metodo e il confronto con metodi alternativi per la valutazione delle dimensioni e della concentrazione dei veicoli elettrici sono stati descritti in precedenza^25,26,27,28. In breve, durante la misurazione NTA, i veicoli elettrici vengono visualizzati dalla luce diffusa quando vengono irradiati con un raggio laser. La luce diffusa viene focalizzata da un microscopio su una fotocamera che registra il movimento delle particelle. Il software NTA tiene traccia del moto termico casuale di ogni particella, noto come moto browniano, per determinare il coefficiente di diffusione che viene utilizzato per calcolare la dimensione di ciascuna particella utilizzando l’equazione di Stokes-Einstein. NTA è stato applicato per la prima volta alla misurazione di veicoli elettrici in un campione biologico nel 2011²⁵. Fino a poco tempo fa, c’erano solo due aziende mainstream che offrivano strumenti NTA commerciali²⁹ fino all’introduzione del ViewSizer 3000 (di seguito denominato strumento di tracciamento delle particelle) che utilizza una combinazione di nuove soluzioni hardware e software per superare i limiti significativi di altre tecniche NTA.

Lo strumento di tracciamento delle particelle caratterizza le nanoparticelle in campioni liquidi analizzando il loro moto browniano e caratterizza particelle più grandi di dimensioni micron analizzando l’assestamento gravitazionale. L’esclusivo sistema ottico di questo strumento, che include l’illuminazione multispettrale con tre sorgenti di luce laser (a 450 nm, 520 nm e 635 nm), consente ai ricercatori di analizzare contemporaneamente una vasta gamma di dimensioni delle particelle (ad esempio, esosomi, microvescicole). Uno schema della configurazione dello strumento è mostrato nella Figura 1.

Qui, dimostriamo come eseguire la distribuzione delle dimensioni delle particelle e le misurazioni della concentrazione di veicoli elettrici isolati di topi e umani utilizzando un nuovo strumento NTA.

Figura 1: Sistema ottico dello strumento di tracciamento delle particelle. Lo strumento NTA illumina le particelle utilizzando tre laser con le seguenti lunghezze d’onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. La registrazione video della luce diffusa dalle singole particelle viene rilevata e tracciata da una videocamera digitale orientata a 90° dalla cuvetta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutto il lavoro con questi campioni è stato eseguito in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali e del Comitato di revisione istituzionale. Una panoramica schematica del metodo NTA è illustrata nella Figura 2. Figura 2: Panoramica del metodo NTA utilizzando l…

Representative Results

Prima di questa dimostrazione, la calibrazione dello strumento è stata prima testata per garantire la validità dei dati acquisiti misurando la distribuzione dimensionale degli standard di perline di polistirene. Abbiamo testato la distribuzione dimensionale di perle da 100 nm e 400 nm utilizzando i parametri di registrazione predefiniti e le impostazioni di elaborazione consigliate in questo protocollo (Figura 8). Per lo standard di perline di polistirene da 100…

Discussion

Qui, dimostriamo un protocollo per NTA di veicoli elettrici per misurare la distribuzione dimensionale di un’ampia gamma di dimensioni delle particelle contemporaneamente e misurare la concentrazione totale di EV in un campione polidisperso. In questo studio, il tessuto adiposo perigonadale di topo e il plasma umano sono stati utilizzati come fonte di veicoli elettrici. Tuttavia, gli EV isolati da altri tessuti o fluidi biologici come siero, urina, saliva, latte materno, liquido amniotico e surnatante di coltura cellular…

Materials

1X dPBS	VWR	02-0119-1000	To dilute samples
100 nm bead standard	Thermo Scientific	3100A	To test ViewSizer 3000 calibration
400 nm bead standard	Thermo Scientific	3400A	To test ViewSizer 3000 calibration
Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC901024	To filter PBS diluent
Collection tubes, 2 mL	Qiagen	19201	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Compressed air duster	DustOff	DPSJB-12	To clean cuvettes
Cuvette insert	HORIBA Scientific	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Cuvette jig	HORIBA Scientific	–	To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000
De-ionized water	VWR	02-0201-1000	To clean cuvettes
Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables	Dell	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%)	Millipore Sigma	–	To clean cuvettes
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Glass scintillation vials with lids	Thermo Scientific	B780020	To clean cuvettes
"Hook" tool	Excelta	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Lint-free microfiber cloth	Texwipe	TX629	To clean cuvettes and cover work surface
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	22363344	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Stir bar	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Quartz cuvette with cap	Agilent Technologies	AG1000-0544	Initially provided with purchase of ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	–	Nanoparticle tracking instrument