アポトーシスは、初期および後期のアポトーシスバイオマーカーのフローサイトメトリー分析によって特徴付けることができます。子宮頸がん細胞株SiHaを、卓上フローサイトメーターを用いてアクチノマイシンDで処理した後のアポトーシスバイオマーカーについて分析した。
アクチノマイシンD処理SiHa子宮頸がん細胞におけるアポトーシスバイオマーカーをベンチトップフローサイトメーターを用いて調査した。アポトーシスの初期バイオマーカー(アネキシンVおよびミトコンドリア膜電位)および後期バイオマーカー(カスパーゼ3および7、およびDNA損傷)を実験培養および対照培養で測定した。培養物を加湿インキュベーター内で37°C、5%CO2で24時間インキュベートした。次いで、細胞をトリプシンを用いて剥離し、フローサイトメトリー細胞数アッセイを用いて列挙した。細胞は、アネキシンVアッセイ、ミトコンドリア電気化学的膜貫通電位アッセイ、カスパーゼ3/7アッセイ、およびDNA損傷アッセイを用いて、アポトーシスについてさらに分析されました。この記事では、アポトーシスと従来のフローサイトメトリーの概要を説明し、SiHa細胞を処理および分析するためのフローサイトメトリープロトコルについて詳しく説明します。結果は、ポジティブ、ネガティブ、および次善の実験データを示しています。また、この分析プラットフォームを使用してアポトーシスのフローサイトメトリー分析を実行する際の解釈と注意点についても説明します。フローサイトメトリー分析は、アポトーシスの初期および後期バイオマーカーの正確な測定を提供します。
1型プログラム細胞死1に分類されるアポトーシスは、細胞増殖と細胞死2の間の平衡を保証します。アポトーシスは、人間の発達中、損傷後、および癌などの疾患の予防に不可欠です3。内因性および外因性のアポトーシス細胞死シグナル伝達経路4は、連続的な生化学的および形態学的細胞内変化を引き起こす2,5,6。形態学的アポトーシスの特徴は顕微鏡で特定でき、生化学的摂動はフローサイトメトリー(FC)7を含む生化学的アッセイで分析できます。
アポトーシスを同定し、関連する細胞内メカニズムを理解するためのフローサイトメトリー解析は、過去20年間で急増しています8。FCは、シングルまたはマルチチャンネルレーザーを通過する流体中の細胞を分析する科学的方法論です(図1)9,10,11。流体中の細胞は、流体力学的焦点合わせを用いてフローサイトメーターの流路系によって単一のファイルに集束される。細胞がレーザーを通過すると、光が散乱または細胞から放出されます。散乱光は、順方向(前方散乱)または側面方向(側方散乱)にすることができ、それぞれセルサイズ、セル粒度または内部構造に関する情報を提供します。
さらに、蛍光色素や蛍光色素で標識された抗体などの蛍光試薬は、特定の表面または細胞内の構造または分子を検出します。レーザーが蛍光色素を励起すると、特定の波長で光が放出されます。検出器(一般的に光電子増倍管)は、細胞サンプルからの散乱光と放出光を定量化します。検出器は、光散乱と蛍光放射に比例する定量化可能な電流を生成します。電子出力は、細胞サイズ、細胞粒度、および蛍光色素標識分子の相対的な細胞蛍光に基づいて細胞集団を識別するための計算ソフトウェアによってデジタル信号に変換されます9、12、13。
図1:従来のフローサイトメトリーの技術的操作とワークフローを説明する概略図。 細胞を蛍光試薬で染色し、レーザーでプローブします。生成された蛍光信号は検出され、電子出力に変換され、コンピュータソフトウェアと統計プログラムによってさらにデジタル化および分析されます。略語:FSC =前方散乱;SSC = 側方散乱。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
FCは、研究と健康診断の両方で使用されます。ネクロバイオロジーにおけるFCの2つの目標は、細胞死の分子的および機能的特性の解明と、細胞死のさまざまなモードの識別です14、15、16、17、18。FCアプリケーションには、細胞列挙、細胞集団のソーティング、イムノフェノタイピング、バイオマーカー検出(アポトーシスバイオマーカーなど)、毒性試験、およびタンパク質工学が含まれます12。さらに、FCは、血液悪性腫瘍患者の診断とモニタリングを支援するために、健康診断に一般的に適用されます。装置、蛍光色素検出、および検出器システムの進歩により、FCアプリケーションは、イメージングサイトメトリー、マスサイトメトリー、スペクトルサイトメトリーに拡大し、より広範な研究アプリケーションとなっています12。
アポトーシスのフローサイトメトリー分析は、細胞の健康状態の評価に使用される従来の技術よりも優れています。FCは、異種サンプル中の多くの単一細胞を迅速かつ再現性よく分析して、アポトーシスを推定することができます3,5。FCは、個々の細胞ベースで細胞表現型に関する定量的情報を提供し、バルク分析を回避する能力により、アポトーシスの分析に利用されるウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、蛍光測定、および分光光度法技術に対して優れた感度を提供します8,19。さらに、ウェスタンブロットやELISAの煩雑で再現性の低い手動ステップとは対照的に、FC分析が比較的容易であるという利点があります。したがって、FCの再現性、正確性、およびハイスループット分析は、癌研究において有益です20。
FCはまた、健常および異常なアポトーシス細胞集団についての細胞周期パラメータの同時分析を可能にする21。アポトーシスは動的なプロセスであるため、さまざまな方法でさまざまな結果が得られ、細胞が採取される時点に依存します22。細胞表現型の複数のパラメータの同時定量的評価は、例えば、0.01%の低頻度の希少細胞サブセットを検出することができる23。マルチパラメトリックFC分析は、アポトーシス連続体に沿ったさまざまなポイントで細胞の初期および後期の生化学的変化のスペクトルに沿ってアポトーシス死が起こるため、特に有用です。例えば、アポトーシス細胞のFC分析において、アネキシンVおよびヨウ化プロピジウムを用いた二重染色の使用は、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞、および死細胞の分類を可能にする24。複数の段階でアポトーシスを正確に検出することで、誤分類や偽陰性の結果を回避できます。したがって、FCによるマルチパラメトリック解析は、細胞表現型を検出する全体的な特異性を改善し、マイナー集団の誤分類を回避する。さらに、FCによる細胞ソーティングにより、その後の分析のために高純度の細胞集団を単離することができます7。
FCの欠点には、懸濁液中の細胞の使用が含まれますが、組織から細胞への分解は細胞機能を変化させる可能性があるため、組織分析では困難な場合があります19。さらに、FC機器のセットアップ、データ分析、およびアッセイレポートの標準化の欠如は、結果19にばらつきを引き起こす可能性があり、データを実行し、分析し、報告するためにFCオペレーターを最適にトレーニングする必要性を強調しています。例えば、FCが真のアポトーシス破片をアポトーシス核から識別する能力には、i)適切な取得設定、ii)二倍体DNAピークを同定するためのキャリブレーションビーズの使用、およびiii)細胞特異的な陰性および陽性細胞コントロールが必要です3。さらに、マルチパラメトリック解析は検出器の数によって制限され、複数の蛍光試薬25を使用する場合に蛍光発光の非特異的な結果やスピルオーバーを回避するために最適な補償を行う必要がある。装置と蛍光色素の技術の進歩により、パラメータ検出は30パラメータに向上しました12。
アポトーシス細胞死の同定は必ずしも単純ではなく7、高感度で特異的なバイオマーカーを検討する必要があります。細胞死に関する命名委員会(NCCD)は、アポトーシスのプロセスの研究と定量化に複数のアッセイを使用することを推奨しています26。古典的なアポトーシスの特徴26 の顕微鏡分析は、アポトーシスを確認し、偽陽性の結果を避けるためにも推奨されます7。初期および後期のアポトーシスイベントにまたがる4つの基本的な生化学的特徴は、(1)細胞膜の非対称性の喪失です。(2)散逸ミトコンドリア膜電位(ΔΨm);(3)カスパーゼ活性化;(4)DNA損傷26。
初期のアポトーシスの間、ホスファチジルセリンは外側細胞膜27に外在化され、フィコエリスリン27、28、29で蛍光標識されたアネキシンVによって検出することができる。さらに、蛍光DNA結合色素である7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)による二重染色により、生細胞、後期アポトーシス細胞、および死細胞が区別されます。したがって、初期アポトーシス細胞はアネキシンVに対して陽性で、7-AADに対して陰性であり、後期アポトーシス細胞とは対照的に、両方の色素に対して陽性に染色する24。
内因性アポトーシスシグナルは、ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)の散逸を誘導する。破壊されたΔΨmは、ミトコンドリア膜間腔から細胞質ゾル27,29,30への初期のアポトーシス促進タンパク質の放出を引き起こす。ΔΨmの変化は、正に帯電した親油性色素、テトラメチルローダミンエチルエステル、TMRE、および7-AADによる二重染色によって評価できます。TMRE色素は、膜電位が高いと無傷のミトコンドリアの内膜内に蓄積します。脱分極ミトコンドリアは蛍光の減少を示します。分極ミトコンドリア(無傷のミトコンドリア膜)を有する生細胞は、TMREに対して陽性であり、7-AADに対して陰性に染色される。脱分極したミトコンドリアを有する死細胞は、TMREに対して陰性であり、7-AAD31に対して陽性である。
カスパーゼは細胞内プロテアーゼのファミリーであり、活性化されるとアポトーシスをシグナル伝達して実行します26,27。末期実行者カスパーゼ(3,6,7)は後期アポトーシス29,32,33に影響を及ぼす。カスパーゼ-3および-7活性は、切断されるとDNAに結合して蛍光シグナルを発する蛍光標識基質によって測定できます。さらに、細胞膜の完全性に対するいかなる妥協も、7-AADで染色することによって評価することができる。アポトーシス細胞は、DNA結合色素に対して陽性に染色しますが、7-AADに対して陰性に染色します。後期アポトーシス細胞および死細胞は、両方の色素34に対して陽性に染色する。
遅発性アポトーシスはDNA損傷27,29,35を特徴とし、これはリン酸化運動失調症変異キナーゼ(ATM)およびヒストンH2A.Xによって評価することができる。XはDNA損傷を決定することができます。ATMとH2Aの両方のネガティブ検出。XはDNA損傷がないことを示し、一方、両方の色素の検出はDNA36における二本鎖切断の存在を示す。
アクチノマイシンDはアポトーシスの強力な誘導物質であり、DNAに結合して転写および翻訳イベントをブロックすることによって作用します37。本研究は、SiHa細胞株におけるアクチノマイシンDによって誘導される生化学的アポトーシスを、アポトーシスの初期段階および後期段階のバイオマーカーを分析することによって評価することを目的とした。アポトーシスの4つの生化学的バイオマーカーは、細胞膜の非対称性の喪失、ミトコンドリア膜電位の変化、末端カスパーゼの活性化、およびDNA損傷を含むアポトーシスカスケードの連続したステップを評価しました。
この研究では、FCによって分析されたアクチノマイシンD処理SiHa細胞は、アポトーシスの有意な初期および後期バイオマーカーを明らかにしました。細胞の調製、列挙、および染色の最適条件では、不正確な結果が特定され、FCを実行する際に製造元の指示を厳密に順守する必要性が強調されました。
早期および後期バイオマーカー同定によるアポトーシスのこの研究は、アポトーシスを調査するためのNCCDガイドライン1に準拠しています。アクチノマイシンD処理SiHa培養は、初期および後期のアポトーシス段階に対して陽性のバイオマーカーを示しました。アネキシンV/PIアッセイおよびミトコンドリア透過性アッセイは、アクチノマイシンDがそれぞれPSフリップパターンおよびミトコンドリア膜転移の散逸を誘導することを示した。アポトーシス細胞がミトコンドリア摂動によって誘導される戻り不能点に達すると、末端カスパーゼが活性化されます3,7。本研究で観察された末端カスパーゼ3および7の活性化は、後期アポトーシスを示す。さらに、末端カスパーゼの活性化は、ヌクレオソーム間DNA切断および広範なDNA断片化を引き起こし、これは古典的にゲル電気泳動によって観察されるステップラダーパターンとして報告されている28,38。
ATMとH2Aによる核の被害。X FC DNA損傷アッセイは、DNAおよび全DNA損傷の二本鎖切断を示した。これらの結果は、実験培養における古典的な下流カスパーゼ誘発アポトーシス核損傷(核狂および核硬化)を確認した。したがって、複数のフローサイトメトリーバイオマーカーを使用することで、アポトーシスにおける連続的な多段階イベントを検出し、初期および後期のアポトーシス段階で正確かつ再現性のある細胞集団を同定しました。これらの知見は、ヒトにおける癌治療におけるアクチノマイシンDの既知のアポトーシス促進性の特徴と一致しており37、39、40、41、さらに、アポトーシスを調査するFC細胞培養実験におけるポジティブコントロールとしてのアクチノマイシンDの使用を支持している。
この研究における細胞集団のゲーティングは、アポトーシスを健康な細胞から分離するネガティブな培地および溶媒コントロールによって知らされました。あるいは、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの集団の混合物を使用して、細胞集団ゲート7、9を設定するために生細胞集団とアポトーシス細胞集団を定義することもできます。罹患細胞状態と健康な細胞状態を定義してゲートすると、テンプレート設定を後続のすべての実験培養および対照培養に適用できます。
誤った結果を避けるためには、FCプロトコルを厳守することが不可欠です。プロトコルの最適化中に、次の問題が観察されました:(1)低い細胞濃度、(2)高い細胞濃度、(3)細胞凝集、(4)長時間の染色、および(5)不十分なサンプル取り扱い。これらの問題は、最適化されたプロトコル要件を厳守することで防ぐことができます。これは、FCが正確なデータを取得するための分析前および分析ステップの重要な性質を強調しています。細胞調製中は、トリプシン処理、ピペッティング、遠心分離、および希釈を慎重に行う必要があります。過剰なトリプシン処理と激しいピペッティングは、それぞれ細胞の化学的および機械的せん断を引き起こす可能性があります。長時間の高速遠心分離は、細胞破壊や細胞破片数の増加につながる可能性があります。細胞イベントの誤った獲得を最小限に抑えるには、最適な細胞濃度が必要です。したがって、初代細胞懸濁液は、最適な細胞濃度を得るために希釈する必要があります。
さらに、サンプルを取り扱う際には、細胞の凝集や断片化を防ぎ、分析中に細胞が懸濁状態のままになるように注意する必要があります。細胞の凝集を防ぐためのサンプルハンドリングは、単一の層流細胞の流れを可能にし、装置のキャピラリーチューブの機械的閉塞を防ぎ、偽の大きな細胞サイズインデックスを抑制します。もう1つの注意点は、アッセイにおける蛍光色素の光酸化と消光を避けるために培養物を光から保護し、偽陰性の結果を防ぐことです。細胞の染色ステップおよびその後の処理ステップでの光曝露を最小限に抑えるように注意する必要があります。さらに、免疫染色時間を長くすると、タンパク質が非特異的に染色されるため、偽陽性の結果が生じる可能性があります。したがって、メーカーが規定したインキュベーション染色期間を順守することが重要です。
要約すると、FCはアポトーシスを正確に検出し、細胞培養における初期および後期アポトーシスバイオマーカーを区別することができる。さらに、技術の進歩により、専門家ではない科学者が細胞の健康状態と複雑な細胞内シグナル伝達経路を研究するためのベンチトップフローサイトメーターが製造されました。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立研究財団(NRF)と南アフリカ医学研究評議会(SAMRC)によって財政的に支援されました。Guava Muse細胞分析装置の購入について、国民保健研究所サービス(NHLS)に感謝したいと思います。この出版物のすべての図は Biorender.com で作成されました。
6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |