サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング
Summary
代謝適応は、分化、持続性、および細胞毒性を決定するため、T細胞にとって基本的である。ここでは、サイトカイン分化型ヒト初代T細胞の エクスビボ でミトコンドリア呼吸をモニタリングするための最適化されたプロトコールが提示される。
Abstract
活性化の間、T細胞の代謝は、その運命に影響を与える変化に適応する。ミトコンドリア酸化的リン酸化の増加はT細胞活性化に不可欠であり、メモリーT細胞の生存はミトコンドリアのリモデリングに依存している。その結果、これは癌免疫療法の長期的な臨床転帰に影響を及ぼす。T細胞品質の変化は、多くの場合、よく知られている表面マーカーを用いたフローサイトメトリーによって研究され、代謝状態によって直接研究されるわけではない。これは、細胞外フラックスアナライザーと、T細胞代謝に異なる影響を与えるサイトカインIL-2およびIL-15を使用して、初代ヒトT細胞のリアルタイムミトコンドリア呼吸を測定するための最適化されたプロトコルです。T細胞の代謝状態は、代謝経路における重要な複合体を阻害する際の酸素消費量を測定することによって明確に区別することができ、これらの測定の精度は最適な阻害剤濃度および阻害剤注入戦略に大きく依存することが示されている。この標準化されたプロトコルは、がん免疫療法のモニタリングおよび研究におけるT細胞適合性の標準としてミトコンドリア呼吸を実装するのに役立ちます。
Introduction
正しいT細胞の発生と機能は、免疫系が抗原を認識して応答する能力に不可欠です。ミトコンドリア酸化リン酸化(OxPhos)は、T細胞の状態に応じて変化する。ナイーブT細胞は主にATPを生成するためにOxPhosを使用しますが、活性化T細胞は解糖系が優勢になる代謝遷移を経験します1。エフェクター期の後、メモリーT細胞のわずかに残ったサブセットは、OxPhos2,3によって支配される代謝状態に戻る。OxPhosの変化は、T細胞のサブセットでさえも、それらの特異的なOxPhos特性によって分化することができる程度までT細胞の分化に続く1。逆に、OxPhosはT細胞の機能にとって重要であり、OxPhosの阻害はT細胞の増殖およびサイトカイン産生をブロックすることが実証されている4。したがって、T細胞OxPhosの特性を正確かつ再現性のある方法で定量化する能力は、T細胞を扱う人にとって強力なツールです。
このプロトコールでは、T細胞OxPhosの特性は、細胞外フラックス分析装置を用いて測定される。この分析装置のコア機能は、分析対象の細胞の増殖培地中の酸素含有量を連続的に測定することである。増殖培地から除去された酸素は、細胞によって取り込まれると仮定される。細胞を様々なOxPhos阻害剤または修飾剤で処理することによって、酸素取り込みの低下が阻害または調節された機能に関連する。例えば、ATP合成酵素の阻害は、酸化的リン酸化によってATPを生成するために使用されるであろう酸素の細胞取り込みの減少をもたらすであろう。クラーク電極やオロボロス装置を含む他の装置は、同様の機能を提供し、各装置には異なる長所と短所があります。これらの装置では、幅広い細胞型を研究に使用できますが、特に困難な細胞型の1つはヒト初代Tリンパ球5です。その小さなサイズ、 生体外での生存率の悪さ、および非接着特性のために、ヒト初代T細胞は研究が困難な場合があります。
これは、細胞外分析装置によるヒト初代T細胞のミトコンドリア呼吸を研究するためのプロトコールである。プロトコルは最適化ランに分割され、ウェルあたりの細胞数の最適濃度、ならびにオリゴマイシンおよびFCCPの最適濃度が決定される。さらに、最適化された条件が使用されるアッセイラン。
血液由来のヒトPBMCおよび エキソビボ 初代T細胞培養物を用いて、このプロトコールは、最適な阻害剤濃度の重要性と、感受性細胞型を扱う際にミトコンドリア阻害剤の逐次注射の代わりに別個を使用することの関連性を実証する。最後に、このアッセイがサイトカインIL-2およびIL-15による分極時のミトコンドリア呼吸の微妙な違いを堅牢に検出できることが実証された。
Protocol
Representative Results
Discussion
酸化的リン酸化の詳細な正確な定量化は、T細胞のエネルギー状態を記述する際に不可欠なツールである。ミトコンドリア適合度の状態は、T細胞の活性化能、生存率、分化に直接関係している可能性があります1,5。このプロトコールにより、酸化的リン酸化の様々な特性を決定することができる(詳細な説明については表4を参照された?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper MølgaardとAnne Rahbechは、Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegatから助成金を受けました。Kasper MølgaardもBørnecancerfondenから助成金を受けました。
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
Referenzen
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