모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출
Summary
이 문서에서는 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델의 신속한 식별을 위한 프로토콜과 고해상도 용융 분석을 사용하여 모기 Aedes aegypti 의 돌연변이 라인을 선택하는 것에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
모기 유전자 편집은 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFNs), 호밍 엔토뉴리스(HEs)와 같은 시스템을 구축하여 여러 실험실에서 일상화되고 있다. 최근에는 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 기술이 정밀 게놈 엔지니어링을 위한 보다 쉽고 저렴한 대안을 제시했습니다. 핵작용에 따라 DNA 수리 경로는 깨진 DNA 끝을 고치고 종종 인델을 도입합니다. 이러한 프레임 외 돌연변이는 표적 유기체에서 유전자 기능을 이해하는 데 사용됩니다. 그러나 단점은 돌연변이 개인이 지배적인 마커를 가지고 있지 않으며, 특히 많은 실험에 필요한 비늘에서 돌연변이 알을 식별하고 추적하는 데 어려움을 겪고 있다는 것입니다.
고해상도 용융 해석(HRMA)은 핵산 서열의 변이를 식별하고 PCR 용융 곡선을 활용하여 이러한 변이를 검출하는 간단한 방법입니다. 이 포스트 PCR 분석 방법은 온도 램프 제어 데이터 캡처 기능을 가지고 쉽게 96 웰 플레이트 형식으로 확장되는 계측과 형광 이중 좌초 DNA 결합 염료를 사용합니다. 여기에 설명된 CRISPR/Cas9 유도 인델의 신속한 검출과 모기 Ae. aegypti에 돌연변이 선의 확립을 위해 HRMA를 사용하는 간단한 워크플로우입니다. 비판적으로, 모든 단계는 다리 조직의 소량으로 수행 될 수 있으며 유전 성 후 수행 될 유전 십자가 또는 phenotyping 애술을 허용, 유기체를 희생 할 필요가 없습니다.
Introduction
뎅기열1, Zika2 및 chikungunya3 바이러스와 같은 병원체의 벡터로, 말라리아 기생충4, 모기는 인간에게 중요한 공중 위생 위협을 나타냅니다. 이러한 모든 질병에 대 한, 모기 벡터의 제어에 전송 개입의 상당한 초점이 있다. 예를 들어 병원균, 모기 적합성, 생존, 번식 및 살충제에 대한 내성에 대한 관건성에서 중요한 유전자에 대한 연구는 새로운 모기 통제 전략을 개발하기위한 핵심입니다. 이러한 목적을 위해, 모기에 있는 게놈 편집은 특히 HEs, ZFN, TALENs와 같은 기술의 발달과 함께, 특히, Cas9를 가진 CRISPR와 같은 기술의 발달과 함께 일반적인 사례가 되고 있습니다. 유전자 편집균의 설립은 전형적으로 오프 표적 및 설립자 (병목 현상) 효력을 극소화하기 위하여 몇몇 세대에 대한 원하는 돌연변이를 운반하는 개별을 백교차하는 관련시킵니다, 동형질 또는 이테로지구우스 선을 생성하는 이종화구우스 개별을 교차하는 뒤에. 지배적 인 마커의 부재에서, 분자 지음은 많은 경우에, 이종화 척 돌연변이에 대한 명확한 현상 특성을 검출 할 수 없기 때문에이 과정에서 필요합니다.
시퀀싱은 지노티픽 특성화를 위한 금본위제이지만, 수백 명 또는 수천 명의 개인에게 이 것을 수행하는 것은 상당한 비용, 인건비 및 결과를 얻는 데 필요한 시간을 초래하며, 이는 모기와 같은 수명이 짧은 유기체에게 특히 중요합니다. 일반적으로 사용되는 대안은 측량체 뉴클레아제 분석5 (SNA), T7E1 분석6 및 고해상도 용융 분석 (HRMA, 검토 7)입니다. SNA와 T7E1은 모두 일치하지 않는 베이스만 갈라주는 엔도니슬리스를 사용합니다. 이종수 돌연변이 게놈의 돌연변이 부위가 증폭되면 돌연변이 및 야생 형 알레의 DNA 단편이 불일치된 이중 좌초 DNA(dsDNA)를 만들기 위해 어닐링됩니다. SNA는 불일치 별 엔도누리스와 간단한 아가로즈 젤 전기포고로 소화를 통해 불일치의 존재를 감지합니다. 대안적으로, HRMA는 dsDNA 결합 형광염료에 의해 검출된 dsDNA의 열역학적 특성을 사용하며, 염료의 분리 온도는 돌연변이의 존재 및 유형에 따라 변화한다. HRMA는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)8, 얼룩말 fish9, 미생물 응용 프로그램10 및 식물 유전 연구의 돌연변이 유전화 등의 검출을 위해 사용되어 왔다.
이 논문은 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 돌연변이 모기에 대한 분자 지노티핑의 간단한 방법인 HRMA를 설명합니다. 대체 기술에 대한 HRMA의 장점은 1) 유연성을 포함, 그것은 다양한 유전자에 유용 입증 된 바와 같이, 인델 크기의 넓은 범위뿐만 아니라 다른 인델 크기와 이질, 동형 구스, 및 트랜스 이테로지구스 분화 사이의 구별12,13,14, 2) 비용, 그것은 일반적으로 사용되는 PCR 에 기초하여, 3) 비용, 저장 그것은 단지 몇 시간 만에 수행 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 작은 신체 부위(leg)를 DNA의 원천으로 사용하여 모기가 genotyping 공정에서 살아남을 수 있게 하여 돌연변이 선의 확립 및 유지를 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
고해상도 용융 해석은 벡터 모기 Ae. aegypti에서 CRISPR/Cas9 기술로 생성된 인델을 식별할 수 있는 간단하고 빠른 솔루션을 제공합니다. 그것은 유연성을 제공, 철 물질 대사에 비행 근육에서 유전자의 넓은 범위에 대 한 돌연변이 모기의 유전자를 사용 하 여 13,14. HRMA는 샘플 수집에서 최종 분석에 이르기까지 단 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다. 프?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
모든 수치는 텍사스 A&M 대학에 라이센스에 따라 Biorender.com 만들어졌습니다. 이 작품은 국립 알레르기 및 감염증 연구소 (AI137112 및 AI115138 에서 Z.N.A.), 곤충 벡터 질병 보조금 프로그램에 따른 텍사스 A&M 농업 연구, USDA 국립 식품 농업 연구소, 해치 프로젝트 1018401 기금으로 지원되었습니다.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
Referenzen
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