Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Summary

Липидные монослои использовались в качестве основы для формирования двумерных (2D) белковых кристаллов для структурных исследований на протяжении десятилетий. Они стабильны на границе раздела воздух-вода и могут служить тонким поддерживающей материалом для электронной визуализации. Здесь мы представляем проверенные этапы подготовки липидных монослоев для биологических исследований.

Abstract

Электронная кристаллография является мощным инструментом для определения структуры высокого разрешения. Макромолекулы, такие как растворимые или мембранные белки, могут быть выращены в высокоупорядоженные двумерные (2D) кристаллы при благоприятных условиях. Качество выращенных 2D-кристаллов имеет решающее значение для разрешения окончательной реконструкции с помощью обработки 2D-изображений. На протяжении многих лет липидные монослои использовались в качестве поддерживающего слоя для содействия 2D-кристаллизации белков периферических мембран, а также растворимых белков. Этот метод также может быть применен к 2D-кристаллизации интегральных мембранных белков, но требует более обширных эмпирических исследований для определения условий моющего средства и диализа для содействия разделению на монослой. Липидный монослой образуется на границе раздела воздух-вода таким образом, что полярные липидные головные группы остаются гидратированными в водной фазе, а неполярные, ацильные цепи, хвосты перегоняются в воздух, нарушая поверхностное натяжение и сплющивая поверхность воды. Заряженная природа или отличительные химические фрагменты головных групп обеспечивают сродство к белкам в растворе, способствуя связыванию для формирования 2D-массива. Вновь образованный монослой с 2D-массивом может быть легко перенесен в электронный микроскоп (ЭМ) на медной сетке с углеродным покрытием, используемой для подъема и поддержки кристаллического массива. В этой работе мы описываем липидную монослойную методологию криогенной электронно-микроскопической (крио-ЭМ) визуализации.

Introduction

Дифракция электронов через 2D-кристаллы или спиральные массивы белков может достигать субнанометровых разрешений в благоприятных случаях^1,2,3. Особый интерес представляют восстановленные 2D мембранные белковые массивы или кристаллы в их почти нативных средах^1. Поскольку кристалл действует как усилитель сигнала, усиливая интенсивность структурных факторов на определенных пространственных частотах, электронная кристаллография позволяет зондирование мишени с меньшим размером при высоких разрешениях, таких как малые молекулы, чем для крио-ЭМ с одной частицей. Электронный пучок может быть дифрагирован упорядоченным 2D-массивом белков, генерируя дифракционную картину или изображение решетки в зависимости от того, где плоскость изображения записывается на^{детекторе 4.} Затем дифракционные интенсивности могут быть извлечены и обработаны для реконструкции 2D-проекционной структуры кристалла. Электроны имеют большее поперечное сечение рассеяния, чем рентгеновские лучи, и его рассеяние в основном следует модели Резерфорда, основанной на кулоновском взаимодействии между электронами и заряженными атомами в молекуле^5. Толщина 2D мембранных кристаллов обычно составляет менее 100 нм, пригодных для передачи электронов без динамического рассеяния, происходящего в образце^6. Было показано, что электронно-кристаллографические исследования можно использовать мощный инструмент для исследования структурной информации с высоким разрешением мембранных белков илипидно-белковых взаимодействий^7,8,9,10,^{11, 12,13,14,15,16,17.}

Монослой липидов представляет собой один единственный липидный слой, состоящий из фосфолипидов, плотно упакованных на границе^{раздела 6}воздух-вода, который может способствовать образованию 2D-массива для растворимых белков или белков периферических мембран^18. В зависимости от плотности липидов и их бокового давления молекулы липидов могут образовывать упорядоченный 2D-массив на границе раздела воздух-вода с их ацильными цепями, расширенными до воздуха и гидрофильных головных групп, выставленных в водном^{растворе1,6,19.} Липидная головная группа может взаимодействовать с белками посредством электростатического взаимодействия или может быть модифицирована для обеспечения метки сродства для связывания определенного белкового домена. Например, DOGS-NTA-Ni (1,2-диолеоил-sn-glycero-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиуксусная кислота)сукцинил]2-Ni²⁺⁾часто используется при формировании липидного монослоя для связывания белков с полигистидовой меткой ^20,21,22. Также холерный токсин В может связывать определенный пентасахарид ганглиозида GM1 в липидном монослое для структурных исследований^23,24. Закрепляя белки на липидных головных группах, липидный монослой может способствовать формированию 2D-массивов, которые являются тонкими для электронно-кристаллографических исследований с высоким разрешением. Липидный монослойный метод был использован в электронной кристаллографии для структурных исследований белков, таких как стрептавидин^2,25,аннексин V^26,холерический токсин^27, E. coli gyrase B субъединица^28, E. coli РНК-полимераза^25,29,30,белки оболочки карбоксисомы³¹ и капсидные белки ВИРУСА ВИЧ-1³² и вируса ^{мышиного лейкоза Молони 33.}Из-за стабильности и химических свойств липидного монослоя были исследованы различные применения для подготовки образцов для крио-ЭМ-визуализации^34. Однако для формирования белкового массива потребуется оптимизация.

Здесь мы предоставляем подробные сведения об общей подготовке липидных монослоев для крио-ЭМ-визуализации и некоторые соображения, которые могут повлиять на качество образующихся монослоев.

Protocol

1. Подготовка тефлонового блока Приготовьте тефлоновый блок из химически стойкой смолы PTFE (политетрафторэтилен). Сделайте отверстия на блоке с помощью общего сверла, за которым следуют размеры, обозначенные на рисунке 1. 2. Однослойный…

Representative Results

Липидный монослой, нанесенный на электромагнитную сетку, может быть визуализирован под просвечивающим электронным микроскопом (ТЭМ) без окрашивания. Присутствие монослоя можно распознать по контрастной разнице с областью без какого-либо образца на пути луча. Области, которые имеют ли…

Discussion

Липидный монослой является мощным инструментом, способствующим росту крупных 2D-кристаллов для структурных исследований биологических макромолекул. Для успешного приготовления интактного липидного монослоя на границе раздела воздух-вода настоятельно рекомендуется, чтобы липиды бы?…

Materials

14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996