インビボ 熟練した運動行動の無線光遺伝学的制御
Summary
本プロトコルは、単一のペレットリーチツー把握タスクにおいて、高速ビデオ撮影と組み合わせた無線光遺伝学を使用して、自由に動くマウスにおける熟練した運動行動の性能に関与する神経回路を特徴付ける方法を記述している。
Abstract
細かい運動能力は日常生活に不可欠であり、いくつかの神経系障害で損なわれる可能性があります。これらのタスクの獲得とパフォーマンスには、感覚運動の統合が必要であり、両側の脳回路の正確な制御が必要です。動物モデルに単手作業の行動パラダイムを実装することで、タスクの実行中に制御条件や疾患における特定の核の神経活動の操作と記録を可能にするため、線条体のような脳構造が複雑な運動行動に寄与することの理解が向上します。
その創設以来、光遺伝学は、ニューロン集団の選択的および標的を絞った活性化または阻害を可能にすることによって、脳を尋問するための支配的なツールであった。光遺伝学と行動アッセイの組み合わせは、特定の脳機能の根底にあるメカニズムに光を当てます。小型化された発光ダイオード(LED)を備えたワイヤレスヘッドマウントシステムは、完全に自由に動く動物の遠隔光遺伝学的制御を可能にします。これにより、有線システムの制限が回避され、発光効率を損なうことなく動物の行動に対する制限が軽減されます。現在のプロトコルは、ワイヤレス光遺伝学的アプローチと高速ビデオ撮影を単手作業の器用さで組み合わせ、特定のニューロン集団の細かい運動行動への寄与を解剖する。
Introduction
運動熟練行動は、私たちが行うほとんどの運動中に存在し、いくつかの脳障害1、2、3、4、5、6に罹患することが知られている。熟練した運動の発達、学習、および性能を研究することを可能にするタスクを実装することは、特に脳損傷、神経変性および神経発達障害のモデルにおいて、運動機能の神経生物学的基盤を理解するために不可欠である2,7,8,9,10,11,12,13 .物体に手を伸ばして取り出すことは、日常生活の行動において日常的に行われ、それは初期の発達の間に獲得され、その後何年もの間5,6を通して洗練される最初の運動能力の1つです。それは、物体の特徴の知覚、運動計画、行動選択、運動実行、身体協調、および速度変調7、14、15、16などの感覚運動プロセスを必要とする複雑な挙動を含む。したがって、単手による高器用なタスクは、両半球16、17、18、19、20、21、22の多くの脳構造の参加を必要とする。マウスにおいて、単一のペレットリーチ・ツー・把持タスクは、別々に制御および分析することができるいくつかの相について特徴付けられる7、13、23。この特徴は、獲得および行動性能の異なる段階における特定のニューロン亜集団の寄与を研究することを可能にし、運動系の詳細な研究のためのプラットフォームを提供する13、23、24。動きは数秒で起こります。したがって、高速ビデオ撮影は、熟練した運動軌道7,25の別個の段階における運動学的解析に使用されるべきである。ビデオから、身体の姿勢、軌道、速度、およびエラーの種類を含むいくつかのパラメータを抽出することができる25。キネマティック解析は、無線光遺伝学的操作中の微妙な変化を検出するために使用することができる7,23。
小型化された発光ダイオード(LED)を使用してワイヤレスヘッドマウントシステムを介して光を送達することで、動物が作業を実行している間にリモートで光遺伝学的制御を行うことができます。無線光遺伝学的コントローラは、刺激器からのシングルパルスまたは連続トリガコマンドを受け入れ、小型化されたLED23、26に接続された受信機に赤外線(IR)信号を送信する。現在のプロトコルは、この無線光遺伝学的アプローチを器用なタスクの高速ビデオ撮影と組み合わせて、微細な運動行動の実行中に特定のニューロン集団の役割を解剖する23。これは単手作業であるため、両方の半球における構造の参加を評価することができます。伝統的に、脳は非常に非対称的な方法で身体の動きを制御します。しかし、器用性の高いタスクは、同側核および核内のニューロン亜集団の差次的寄与を含む多くの脳構造からの慎重な調整および制御を必要とする10、20、21、22、23。このプロトコルは、両半球からの皮質下構造が前肢23の軌道を制御することを示している。このパラダイムは、他の脳領域および脳疾患のモデルを研究するのに適している可能性がある。
Protocol
動物の使用を含む手順は、地域および国のガイドラインに従って実施され、対応する機関動物ケアおよび使用委員会(細胞生理学研究所IACUCプロトコルVLH151-19)によって承認された。C57BL/6バックグラウンドを有する生後27、35〜40日目のDrd1−Creトランスジェニック雄マウスを、現在のプロトコールにおいて使用した。マウスを以下の条件で飼育した:温度22±1°C;湿度55%;ライトス?…
Representative Results
リーチ・トゥ・サクセス・タスクは、さまざまな実験操作の下での細かいスキルの動きのシェーピング、学習、パフォーマンス、および運動学を研究するために広く使用されているパラダイムです。マウスは数日でタスクを実行することを学び、5日間のトレーニング後にプラトーに達する55%以上の精度を達成します(図2A、B)。以前に報告されたものと同様?…
Discussion
明確に定義された行動パラダイムにおけるニューロン集団の光遺伝学的操作の使用は、運動制御の根底にあるメカニズムに関する我々の知識を進歩させている7,23。無線方式は、複数の動物または自由運動34,35での試験を必要とするタスクに特に適している。それにもかかわらず、技術と装置が洗練される…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、UNAM-PAPIITプロジェクト IA203520によって支援された。我々は、IFCの動物施設がマウスコロニーの維持管理に協力し、ITサポートのための計算ユニット、特にFrancisco Perez-Eugenioに感謝する。
Materials
| Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
| Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
| Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
| Cotton swabs | |||
| CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
| Customized training chamber | In house | ||
| Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
| Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
| Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
| Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
| Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
| Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
| High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
| Infrared emmiter | Teleopto | ||
| Insulin syringe | |||
| LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
| Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
| Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microtome | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
| Oxygen tank | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
| Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
| Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
| Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
| Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Scalpel | |||
| Scalpel blade | |||
| Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
| Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
| Surgical dispossable cap | |||
| Teleopto remote controller | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
| Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |
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Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).